分选突变 scFv 文库以获取高亲和力克隆

Boder 等建立了一种产生和分离特定 scFv 的高亲和力突变体方法，这可以通过 scFv 结合解离常数 K，从 nM 到 fM 成熟过程证实。有数种方法可构建突变文库，此处不做叙述。然而，有几条必须遵循的规则。每个克隆发生突变的数量将影响到具有功能的全长 scFv 突变体的数量，同样，它们也会影响亲和力增强的克隆发现的可能性。

分选突变 scFv 文库以获取高亲和力克隆的基本过程可分为如下几步，106～107 个不相同的突变体组成的文库可以用以下方法很容易进行筛选。

A 用 10 倍覆盖率的最小量培养和诱导文库。

B 标记不超过 108 个细胞（这需要大约 3 h，其分选速度为每秒 10000 个细胞）。

C 用抗 c-myc 抗体标记酵母菌以鉴定全长 scFv 抗体克隆，这种突变会导致大量蛋白表达的终止和截短。同时，在亲代克隆达到 K，值时加入抗原。室温孵育 30 min，离心收集细胞前冰浴 5 min，清洗细胞 2 次。继续进行第 4 步。
对于已具备亚 nM 亲和力的克隆有一种替代的方法可产生更多的克隆的亲和力突变。可以通过下列较快的结合率和较慢的洗脱率相结合的方法来选择克隆：

①在 25℃ 标记生物素化抗原 1 h，不要标记抗 c-myc 抗体。

②在洗去未结合抗原后，用 100 mL 25℃ 的洗涤缓冲液重悬细胞。在 25℃ 孵育样本 1～24 h（取决于形成文库的亲本抗体的解离速率）。在孵育过程中更换缓冲液 2 次。

③离心收集细胞并用 c-myc 标记 25℃30 min，然后再将其洗 3 次。

④用 GaM-Alexa 488 和 SA-PE 二抗重悬细胞，4℃ 标记 30 min。

⑤接下来操作步骤 5。

D 用二抗重悬细胞，避光冰浴 30 min，洗涤 1 次后再重悬细胞。

E 分选样品，分选样品中 c-myc 阳性抗原标记细胞群最亮的 1％ 部分，预计细胞中 5％～20％ 表达 c-myc 阳性 scFv，其中 10％～20％ 将结合抗原。

F 将细胞接种于包含抗生素的选择性平板，或在选择性液体培养基（大约 5 mL SD＋CAA）。抗生素可以是下述几种的任何一种或全部：100 μg／mL 的青霉素／链霉素（10 mg／mL）或 10～20 μg／mL 氨苄青霉素、卡那霉素（10 mg／mL）。

G 平板在 30℃ 孵育 1～2d，菌落融合生长，然后进行诱导。液体培养基生长的细胞离心分离后进行诱导。一部分细胞常规冻存。

H 从 107 个细胞中约可分选出总量 103～104 个细胞，一般情况下，50％ 的细胞将会形成克隆或者具有生长活性。在随后的分选中，70％ 的细胞将 c-myc 阳性，绝大多数细胞会结合抗原。

I 在第一轮筛选的酵母菌重新生长和诱导后，108 个细胞可用浓度为 0.5～0.1XKD 的抗原标记。

J 分选结合和抗原 c-myc 双阳性克隆中荧光强度最高的 0.1％ 细胞。注意：亚文库总体的 KD，值可用小标题 3.5.2 描述单个克隆 K，测定相似方法测定。一般说来，我们用达到 KD 时的抗原浓度进行第一轮分选，随后的每次分选降低浓度 2～10 倍。

K 后面两轮重复步骤 F～J。

L 单个克隆可以对 K，进行测定，并对插入片段进行测序，能够确定独特克隆的数量和亲本克隆发生特异变化的位点。一般说来，通过四轮筛选，在亚文库中 80％ 的克隆为造后的突变体。

常见问题 1

问题表现：我们使用的一些蛋白好像能与所有的酵母菌结合，为什么？

解决方案：在任何一轮筛选前，我们在未诱导和诱导的文库中常规检测能够结合到的单个未诱导的 scFv 克隆上的目的蛋白。在以上任何情况下，应该看不到标记物。如果存在标记物，则可能是在酵母菌表面或 scFv 的非特异性结合。我们有大量关于多肽和分泌蛋白的可重复结果和实验。然而，我们也获得过针对多种胞质蛋白的抗原特异性 scFv。因此，我们建议尝试用不同的选择缓冲液以减少或消除非特异性结合。如不含 EDTA 的 0.1％Tween-PBS 等等。

常见问题 2

问题表现：我已经进行了五轮筛选，而我获得的仅仅为二抗标记结合物，或一无所获，问题何在？答：这有很多种原因，最常见的问题例举如下：

解决方案 1：（1）你要检查一下流式细胞分选仪的设置是否合适？流式细胞仪操作人员有没有向你演示分选了哪一位部分细胞？或者用标记的磁珠进行试分选？你是否从把分选的细胞进行稀释培养？你所期望的数量是多少？一般来说，我们从分选的细胞数量中能够获得 40％～70％ 的集落形成率。

（2）你确定你的抗原是生物素化抗原么？如何确定？我们使用 Pierce HABA 方法来鉴定每摩尔抗原标记的生物素摩尔数，尽量达到 1～2mol 生物素／摩尔抗原。

（3）尽量增加抗原浓度直至 1μM。

（4）也有可能文库中没有你目的抗原相结合的 scFV

常见问题 3

问题表现：我能否仅使用流式细胞术分选或仅使用磁珠分选来获得抗原特异性克隆？

解决方案 1：答：可以。但是，我们相信将两者结合是最有效的筛选基因文库所有多样性的方法。在我们的论文中 HEL 为仅使用 MACS 系统进行分选。