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        流式细胞分选前 MACS 柱分离所得细胞的荧光标记

        相关实验:流式细胞术筛查酵母菌表面展示文库实验

        最新修订时间:

        简介

        在每轮筛选前均用抗 HA、抗 c-myc 抗体和第 2 步对照标记文库是非常重要的。这便确立了数个重要基础:①我们的酵母菌正确诱导了吗?②表达 c-myc(即全长 scFv)的比例是多少?③我的二抗试剂有非特异性结合吗?④我们富集的是否是二抗的结合物?如果你打算使用 SA-PE 标记抗原结合细胞,你应当在诱导细胞中加入适当的 SA-PE 看它是否与之结合。GaM 试剂的质控管应当被标记和分析(不加入抗 c-myc 抗体)。一般来说,我们会看到很少标记,小于 0.1%,也可以偿试其他二抗 [即中性亲和素、链霉亲和素或抗生物素单克隆抗体(MAb)] 使二抗非特异性结合物最小程度富集。

        材料与仪器

        器材:恒温水浴锅、离心机等。

        试剂:

        ①抗-HA(12CA5)抗体。

        ②抗 c-myc 抗体(克隆号为 9E10)(Amersham Biosciences,皮斯卡特维,新泽西州;or Co-vance,Babco,坎伯兰,弗吉尼亚州);pPNL6 来源基因文库 200 μg/ml;或 pYD1 基因文库抗 V5 单克隆抗体。

        ③Alexa 488 标记的羊抗鼠(GaM)抗体(Molecular Probes,尤金,俄勒冈州)。

        ④Alexa 633 标记的羊抗鼠(GaM)抗体(Molecular Probes)。

        ⑤PE 标记的羊抗鼠(GaM)抗体(Molecular Probes)。

        ⑥R-PE 标记的链霉亲和素-(SA-PE)(Molecular Probes)。

        ⑦Alexa 633 标记的链霉亲和素-(SA-633)(Molecular Probes)。

        ⑧Alexa 647 标记的链霉亲和素-(SA-647)(Molecular Probes)。

        ⑨异硫氰酸荧光素(FITC)标记的 Neutravidin(NA-FITC)(Molecular Probes)。

        ⑩PE 标记的中性亲和素-(NA-PE)(Molecular Probes)。

        ⑪生物素化的纯化抗原,2 μg/kDa 抗原。

        ⑫青霉素/链霉素,100X 组织培养级(GibcoT Invitrogen 公司)。

        ⑬洗涤缓冲液/缓冲液:磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),0.5% 牛血清白蛋白(BSA),和 2 mM EDTA。

        步骤

        流式细胞分选前 MACS 柱分离所得细胞的荧光标记的基本过程可分为如下几步:

        A 加 5μl9E10 抗 c-mye 抗体(浓度为 200 μg/mL)到 500μl 含(1~10)x10 酵母菌的磁柱洗脱液中,这时也可加入 100nM 生物素化抗原。但是,如果细胞在磁柱筛选过,应仍有原结合,则不需要加入。

        B 冰浴 30 min,高速离心沉淀 10s,再用 500μl 缓冲液洗 2 次。

        C 加入 1:200 稀释后的二抗(检测 c-myc 用 GaM-Alexa 488,检测生物素化抗原用 SA-PE)(图 17-4)。

        流式细胞分选前 MACS 柱分离所得细胞的荧光标记

        D 冰浴 30 min,离心收集细胞,再用 500μl 用冰预冷的清洗缓冲液洗 2 次。
        E 用 1 mL 缓冲液重悬细胞,分选前持续避光冰浴。

        来源:丁香实验

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