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        种特异巢式 PCR

        相关实验:巢式 PCR

        最新修订时间:

        简介

        种特异巢式 PCR 是针对种特异的基因设计引物,能够区分同一属内不同种的微生物。

        原理

        种特异巢式 PCR 的基本原理是:在种特异 PCR 中,扩增基因一般选择在较为保守的 16S rRNA 和 23S rRNA 内。微生物在其分类中有严格的分类方法,例如门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species), 种是生物分类中基本的分类单元和分类等级。属于同一种的微生物在进化中形成了一部分保守的基因序列。因此可用 PCR 扩增其相应的 rDNA 片断,来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌。

        用途

        种特异巢式 PCR 的常用应用领域如下:细菌鉴定和分类。

        材料与仪器

        器材:PCR 扩增仪、电泳仪

        试剂:

        ① 模板: 基因组 DNA 或 cDNA

        ② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

        ③ 10 umol/L 四条特异引物: 两条外引物,两条内引物

        ④ TaqDNA 聚合酶及其 10× PCR 缓冲液

        ⑤ 高压灭菌去离子水

        步骤

        种特异巢式 PCR 的基本过程可分为如下几步:

        (一)模板

        利用基因组提取试剂盒提取临床标本或者培养物中的基因组 DNA, DNA 重悬于无菌水中,定量为 1 μg/ml。

        (二)引物设计

        通常在同一种内的微生物,16 S rDNA、23 S rDNA 序列都较为保守,因此在种特异巢式 PCR 中,扩增的目的片段通常选择在这些序列中,也可选择其它较为保守的序列。通过进化树分析,选择那些种内保守而又能够区分不同种的序列来设计引物。扩增片段大小没有固定的要求,通常在引物中不设计简并碱基。引物设计原则同常规 PCR。外引物可以针对同一属的保守序列,而内引物可以针对种特异的序列保守区,从而通过种特异 PCR 区分同一属内的不同种微生物。

        (三)种特异巢式 PCR 反应

        A. PCR 反应体系:

        设立 50 pl 的 PCR 反应体系,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

        10× PCR 缓冲液 5 μl

        DNA 或 cDNA 模板 5 μl

        2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

        Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl

        10 μmol/L 的外引物 (P1、P2) 各 1 μl

        H2O 至 50 μl

        如果 PCR 仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油 (约 50 μl)。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

        B. 设置 PCR 反应条件:

        预变性 94 ℃,3 min

        变性 94 ℃,30 s

        退火 55 ℃,30 s 30 个循环

        延伸 72 ℃,60 s

        延伸 72 ℃,7 min

        PCR 反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

        C. 进行第二轮 PCR 反应,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

        10× PCR 缓冲液 5 μl

        第一轮 PCR 产物 5 μl

        2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

        Taq DNA 聚合酶 (5 U/μl) 0.5 μl

        10 μmol/L 的正反向内引物 (P3 ,P4) 各 1 μl

        H2O 至 50 μl

        PCR 反应条件同第一轮。

        D. PCR 产物的检测

        反应结束后,用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

        注意事项

        在引物的设计方面需要进行严格分析。由于 16 S rDNA 序列在原核生物中的高度保守性,对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差。23 S rRNA 分子比较大(约 3 kb), 并且只有少数种的核酸序列被报道,尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用。16 S~23 S rDNA 区间(intergenic spacer region, ISR)由于没有特定功能和进化速率,比 16S rDNA 大 10 多倍,近几年来在细菌鉴定和分类方面备受关注。一些细菌的 16 S~23 S rDNA ISR 的数目、大小和序列已经报道,它们之间的不同使其在细菌系统发育学,特别是相近种和菌株的区分和鉴定方面占据了一席之地。因此要根据实验要求选择不同的保守区设计引物。

        来源:丁香实验

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