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        5’-快速扩增技术分析启动子转录活性

        相关实验:启动子转录活性分析

        别名:rapid amplification of cDNA end, RACE

        最新修订时间:

        简介

        cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA end, RACE ) 是一种基于PCR反应的,对cDNA的5'-端或3'-端的有效扩增技术。

        原理

        cDNA 5’-末端快速扩增技术的基本原理是首先利用待研究的 mRNA 或 ncRNA 中已知的序列设计一条基因特异性引物 (gene-specific primer, GSP),并以该转录本为模板进行反转录得到 r:DNA 的第一链;


        接着在末端脱氧核糖核酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl tranferase, TdT ) 的催化下将 dATP 逐个加到新合成的 rDNA的 3'- 端,形成 polyA; 再利用含有部分接头序列的通用引物 (universal amplification primer,UAP ) 和GSP 分别作为上游引物和下游引物、经PCR扩增获得已知信息区和 polyA 尾之间未知的5'-端的 RNA 序列。


        为(提高扩增的特异性,还可以再设计一条巢式基因特异性引物 (nested gene-specific primer, NGSP) 和接头引物来进行第二轮的PCR。

        用途

        cDNA的5 '-端快速扩增技术用于分析转录起点和启动子序列。

        材料与仪器

        器材:


        涡旋震荡仪、水浴锅、切胶仪。


        试剂:


        ①第一链缓冲液,5X、DTT(20 mmol/L)、dNTP混合液(10 mmol/L)、SMARTer IIA oligo ;


        ②5'-RACE cDNA合成反应液:RNA酶抑制剂(40 U/µl) 、SMARTScribe反转录酶(100 U) ;


        ③TE缓冲液。

        步骤

        cDNA的5 '-端快速扩增技术的基本过程可分为如下几步:


        A.首先按下表为每个cDNA合成反应配制混合液,短暂离心后于室温放置,直至步骤E:


        第一链缓冲液,5X 2.0 µl
        DTT(20 mmol/L) 1.0 µl
        dNTP混合液(10 mmol/L) 1.0 µl

        总体积 4.0 µl


        B在1.0~2.75 µ1的总RNA中加入1.0 µl的5'-CDS引物A(试剂盒专配),用无菌水补足至3.75 µl,混合均匀并短暂离心。


        C.72 °C水浴锅中加热3 min,接着放置于42 ℃环境冷却2 min, 14000 g短暂离心以收集管盖上的残留液体。


        D.加入1.0 µl的SMARTer IIA oligo,振荡混合均匀并短暂离心。


        E.按下表配制5'-RACE cDNA合成反应液:


        步骤l中配制的混合液 4.00 µl
        RNA酶抑制剂(40 U/µl) 0.25 µ1
        SMARTScribe反转录酶(100 U) 1.00 µ1

        总体积 5.25 µl


        F. 将步骤D和步骤E中得到的溶液,混合,此时反应总体积为10 µl。


        G.于42 ℃孵育90 min后放入70 ℃ 水浴锅中加热10 min。


        注意事项:水浴锅提前加热;


        H. 短暂离心,将cDNA合成产物用TE缓冲液稀释(若用于合成反应的RNA总量小于200 ng, 加入20 µl的TE; 若大于200 ng, 则加入100 µl的TE)。


        I.以上述得到的cDNA为模板,以UAP和GSP分别作为上下游引物,进行PCR反应。


        J.切胶回收特异的目的条带,连入T载体并送测序,最后通过序列比对分析可以最终得知该基因的转录起始位点。

        来源:丁香实验

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