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        滤泡辅助性T细胞染色技术

        相关实验:T淋巴细胞亚群染色技术

        别名:Tfh细胞染色技术

        最新修订时间:

        简介

        滤泡辅助性 T 细胞 (T follicular helper cells, Tfh) 染色技术是指利用表面标记分子对 Tfh 细胞进行染色,以进一步深入研究该群细胞的表型和功能。

        原理

        滤泡辅助性 T 细胞染色技术是指利用表面标记分子对 Tfh 细胞进行免疫荧光染色和流式细胞分析,以鉴定 Tfh,便于进一步深入研究该群细胞的表型和功能。Tfh 是新近确定的 一个 CD4+T 细胞亚群,其表面标志是表达 CD4 和趋化因子受体 CXCR5(CD3+ CD4+ CXCR5+)。 Tlh 是辅助 B 细胞发挥体液免疫应答效应的主要细胞亚群。

        材料与仪器

        器材:

        流式细胞仪、单染管、离心机

        试剂:

        ① 荧光标记的特异性单克隆抗体及同型对照抗体;

        ②细胞洗液。含 2% BSA、0.2% NaN3 的 PBS,固定液(1% 多聚甲醛 PBS,pH7.2);

        ③人丙球蛋白。

        耗材:

        流式专用样品管、玻璃管

        步骤

        滤泡辅助性 T 细胞染色技术的基本过程可分为如下几步:

        (1)人外周血单个核细胞(PBMC)分离。

        (2)用流式洗液调整 PBMC 悬液密度为 2 x 108 L-,取 25μl 细胞悬液加入 1 μg 人丙球蛋白,室温封闭 15 min。

        (3)加入 10 μl Percp-CXCR5 mAb,4 ℃ 孵育 30 min。

        (4)同时加入 FITC-CD4 及 PE-CD19 mAb 各 20 μl,对照管分别加入各色的同型对照 mAb,各色单染管用于补偿调节,4 ℃ 孵育 30 min。

        (5)每管加入 PBS 洗液 3 ml,1500 r/min 离心 5 min,弃上清。

        重复洗 1 遍,加入 400 μl 流式固定液悬浮细胞,上机检测。

        (6)所有样品用 BD FCS Calibor 进行分析,用 488 nm 激发光,前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)以线性信号收集。FSC-SSC 散点图上圈出单个核细胞群,用补偿管调节消除各色之间的荧光重叠,检测各色荧光强度,测定时各荧光通道均以相应同种型(isotype)IgG 染色细胞作阴性对照。

        注意事项

        1. 荧光抗体染色后充分洗涤,注意混匀和离心速度,减少重叠 细胞和细胞碎片。
        2. 设置对照样品,采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧 光抗体的本底对照。

        常见问题

        判定结果时,为使免疫荧光的定量分析更精确,注意减去本底荧光,应用计算机程序软件,用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值,可以得到更准确的免疫荧光定量结果。

        来源:丁香实验

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