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        猪卵母细胞冻存保存方法

        相关实验:猪配子和胚胎的冷冻保存

        最新修订时间:

        简介

        冻存(cryopreservation)是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于 -196 ℃ 液氮中低温保存,可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来,这样在需要的时候再复苏用于实验。适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢,可以防止因意外事件而造成丢种,起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。除此之外,还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。

        原理

        冻存技术的原理是加入保护剂,如终浓度 5%~15% 的甘油或二甲亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。采用「慢冻快融」的方法能较好地保证胚胎、配子或卵巢的存活。

        材料与仪器

        器材:

        ① 冻存管

        ② 无菌移液枪、枪头

        ③ 超低温冰箱

        ④ 玻璃微细管

        ⑤ 开放式拉长麦管

        ⑥ 凝胶上样管

        ⑦ 维纳斯剪刀

        试剂:

        ① 材料:大鼠

        ② 含 10% FCS 的 TCM199 或 PBS

        ③ EFS40,EFS30,GFS40,EDFS

        ④ 液氮

        ⑤ DMSO

        ⑥ 丙三醇

        ⑦ 盐酸肾上腺素

        步骤

        一、猪卵巢冻存的基本方法有如下几种:


        (一)OPS(open pulled straw)法

        1. 将 GV 期或 MII 期卵母细胞经 TCM199 清洗后,转移到预处理液 1 中,平衡 5 分钟,再转移到数个约 100 μl 的 EFS40 小滴中,每滴约含卵母细胞 16 枚,然后平衡 1 分钟。

        2. 利用虹吸或注射器吸入麦管,然后直接投入到 -196 ℃ 液氮中。


        (二)GMP(glass micropipette)法


        1.GMP 管由直径为 0.30 cm 左右的玻璃管在酒精灯外焰上加热煅烧,拉制成外径约为 0.3 mm 的微管。

        2. 卵母细胞经 M199 清洗后,先在预处理液 I 中平衡。

        3. 平衡完后,玻璃化液滴中,每滴约 12 枚卵母细胞,并平衡 1 分钟。

        4. 在平衡过程中装管。在将卵母细胞吸人 GMP 管时,若卵母细胞全部吸入,可不吸入剩余的冷冻液并尽量使冷冻液和卵母细胞位于拉细的部分,以保证卵母细胞周围含尽量少的抗冷冻剂。

        5. 装管完成后,直接投入到 -196 ℃ 液氮。

        (三)GLT(gel-loading tip)法

        1. 卵母细胞进行随机分组后,转移到预先在 37 ℃ 恒温台上平衡的预处理液中,平衡 5 分钟,再转到玻璃化冷冻液中。

        2. 根据实验要求可控制再玻璃化液中的平衡时间。用做好标记的 GLT 分别吸入含玻璃化液卵母细胞,每管约 12 枚细胞。

        3. 放入小口袋中直接投入到 -196 ℃ 液氮。

        二、猪卵母细胞的解冻过程


        1. 实验前 2 小时调节室温及预先 37 ℃ 平衡解冻液,从液氮中取出冷冻管,在 37 ℃ 水浴中晃动 10 秒,立即取出拭去水珠,将内容物吹出于表面皿中的解冻液 I 中。


        2. 转入新鲜的蔗糖溶液中平衡 5 分钟,再转入到解冻液 II 中平衡 5 分钟。


        3. 在 TCM 199 液平衡 10 分钟,以充分洗去冷冻保护剂。


        4. 将卵母细胞放入 CO2 培养箱中培养,条件 39 ℃、5% CO2、饱和湿度,待检测或体外受精。

        来源:丁香实验

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