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        猪精子冻存保存方法

        相关实验:猪配子和胚胎的冷冻保存

        最新修订时间:

        简介

        冻存(cryopreservation)是生物材料保存的主要方法之一。利用冻存技术将胚胎、配子或卵巢置于 -196 ℃ 液氮中低温保存,可以使胚胎、配子或卵巢暂时脱离生长状态而将其生理特性保存起来,这样在需要的时候再复苏用于实验。适度地保存一定量的胚胎、配子或卵巢,可以防止因意外事件而造成丢种,起到了胚胎、配子或卵巢的保种作用。除此之外,还可以利用冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些特殊基因型的胚胎、配子或卵巢。

        原理

        冻存技术的原理是加入保护剂,如终浓度 5%~15% 的甘油或二甲亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。采用「慢冻快融」的方法能较好地保证胚胎、配子或卵巢的存活。

        材料与仪器

        器材:

        ① 冻存管

        ② 无菌移液枪、枪头

        ③ 超低温冰箱

        ④ CO2、37 ℃ 恒温箱

        ⑤ 纱布、转子、剪子和镊子(2 把)

        ⑥ 温度计、离心管座、冰袋、2 L 烧杯、干冰及鲜鸡蛋


        试剂:


        ① 材料:猪

        ② Tes、Tris、PBS

        ③ 葡萄糖、卵黄、十二烷基硫酸钠(SDS)

        ④ 液氮

        ⑤ 甘油

        ⑥ 精子洗涤液

        ⑦ 冻液 I 液、冻液 II 液

        步骤

        猪精子冻存的基本过程可分为如下几步:

        1.鲜精采集

        用手握法采集精液,40 ℃ 水浴带回实验室,选择无异味、色泽为乳白色、精子形态正常、活率在 80% 以上,密度为「密」的精液用于实验。

        2.精液稀释

        (1)精液预处理:新鲜精液经品质评定合格后,用 4 层纱布进行过滤,过滤后的液体按 1:1 比例加入洗涤液进行洗涤,加液体时一定让液体顺着管壁流下去,不可直接冲到精液上,以免精子的损伤,随后进行离心(1000 g.5 分钟),去上清。

        (2)冻液 I 液稀释和平衡:在精液完成预处理后,按照 1:1-1:2 的比例立即用冷冻液 1 液进行稀释,用枪头轻轻混匀,放入 4 ℃ 水浴(水不宜过多,以 600 ml 为宜,烧杯放到 4 ℃ 冰箱里,烧杯底部放冰块,在 4 ℃ 冰箱里平衡 90 分钟,使其降至 4 ℃)中降温。

        (3)冷冻液 II 液稀释和平衡:将经过第一次稀释和平衡的精液在冰箱内按 1:1 比例用等温 II 液稀释,充分混匀后继续放到冰箱中平衡 5 分钟。

        3. 精液冷冻 平衡好的精液滴冻到干冰上,每滴 100 μl,滴冻 1 分钟,随后装入扎眼的离心管中,最后将冷冻的颗粒浸入液氮内。

        4. 精液解冻 采用湿解冻法解冻,以 BTS 液为解冻液。42 ℃ 水浴,解冻后 1000 g,5 分钟重复离心两次.用 DPBS 重新悬浮,镜检。

        来源:丁香实验

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