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        凝胶柱层析法提纯抗体

        相关实验:抗体纯化实验

        最新修订时间:

        简介

        凝胶柱层析法也称分子筛层析、排阻层析,是根据蛋白质分子量大小不同,将蛋白质组分由大到小依次分离出来。

        材料与仪器

        器材:层析仪 1 套;2.5x100 cm 层析柱;滤网(滤纸);1000 ml 烧杯;5 ml 吸量管;试管。

        试剂:

        ① 0.05mol/L pH8.0 磷酸缓冲液(PB):0.2mol/L Na2HPO4 溶液 94.7 ml,0.2mol/L NaH2PO4 溶液 5.3 ml 混合后,蒸馏水稀释至 400 ml;

        ② Sephadex G-200 干胶 20 g;


        步骤

        凝胶柱层析法提纯抗体的基本过程可分为如下几步:

        A 凝胶处理:Sephadex G-200 使用前应用水充分膨胀,一般需膨胀 72 小时。为节约时间,也可煮沸 2-4 小时,并重复漂洗 2-3 次。

        B 装柱:柱内径和高度之比为 1:20-1:50 范围的层析柱,与蠕动泵、紫外监测仪相连,并向柱内加入 1/3 高度的缓冲液,将溶胀的 Sephadex G-200 凝胶用缓冲液调成糊状,沿柱内壁填充到柱内,待其部分自然沉降后,吸出部分上清,再加入凝胶,反复数次,直至凝胶距柱上口 6-8 cm,在凝胶上放一直径略小于柱内径的圆形滤纸片,使其平铺在凝胶柱面上。

        目的是避免加样或加缓冲液时破坏凝胶柱界面的平整,并能防止样品中的颗粒进入凝胶柱。按 0.2 ml/min 流速,连续冲洗,使柱充分平衡后上样,Sephadex G-200 柱一般需平衡 4 小时以上。


        C 加样:吸去滤纸片上层缓冲液,加入 2 ml 经饱和硫酸铵沉淀的抗体样品,待样品完全进人层析凝胶柱后,再加满洗脱缓冲液。

        D 洗脱:用 0.05mol/L pH8.0 磷酸缓冲液,以 0.1 ml/min 速度洗脱,记录洗脱图谱,分步收集洗脱组分(2 ml/管)。

        E 检测:收集的样品采用紫外分光光度计法检测蛋白含量,蛋白主峰为 IgG,可进一步检测 IgG 免疫学活性和纯度。


        注意事项

        1、装柱过程切忌有气泡和断层,若有断层,需倾倒出填料,重新装柱。

        2、加样时,注意缓冲液界面恰好在滤纸片上,及时加样,不能出现因放液过快使凝胶柱干涸现象,否则凝胶不能继续使用。

        3、整个层析过程时间较长,要求在 4℃ 环境中操作,以防蛋白活性下降。


        来源:丁香实验

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