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        不同分子量蛋白质的分离——凝胶柱层析法

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        目的要求

        (1)了解凝胶柱层析 的原理及应用。

        (2)掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

        实验原理

        凝胶层析又称凝胶过滤,是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱 中,然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中,只留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此以较快的速度首先流出层析柱,而小分子则能自由出入凝胶颗粒中,并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡,因此就要花费较长的时间流经柱床,从而使不同大小的分子得以分离。

        凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致,且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外,而对某些小分子 化合物则不能排阻,但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav(被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积(Vt)、外水体积(Vo)及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关,即:

        Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)

        在限定的层析条件下,Vt和Vo都是恒定值,而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大,Kav值小;反之,则Kav值增大。

        通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大(为200万),呈蓝色,它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻,并可借助其本身颜色,采用肉眼或分光光度仪检测(210nm或260nm或620nm)洗脱体积(即Vo)。但是,在测定激酶等蛋白质的分子量时,宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积,因为它对激酶有吸附作用,所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积(Vi)的物质,可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯,或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

        本实验使用血红蛋白(分子量64,500左右)和二硝基氟苯-鱼精蛋白(DNP-鱼精蛋白分子量12,000左右)的混合物,通过Sephadex G-25层析后达到分离。

        试剂和器材

        一、试剂

        0.9% NaCl;10% NaHCO3);95%乙醇。

        pH 7.0凝酸缓冲液(20mM磷酸二氢钠:20mM磷酸氢二钠=31mL:69mL)

        二、 材料

        血红蛋白溶液(Hb):取抗凝血(肝素)2mL,离心弃去上层血浆。用0.9%NaCl洗血细胞数次(颠倒混匀,离心,弃去上清液),使离心后上清液几乎无淡黄色为止。于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸馏水摇匀,离心去沉淀(破碎的细胞膜等)即为Hb稀释液备用。

        DNP-鱼精蛋白溶液:取鱼精蛋白0.15g溶于10%NaHCO3溶液1.5mL中(此时该蛋白质溶液pH应在8.5~9.0左右)。另取二硝基氟苯0.15g,溶于微热的95%乙醇3mL中,待其充分溶解后立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中煮沸5分钟,注意防止乙醇沸腾溢出。冷却后加2倍体积的95%乙醇,可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。离心(300r/m)5分钟,弃去上清液,沉淀用95%乙醇洗2次,所得沉淀用1mL蒸馏水溶解,即为DNP-鱼精蛋白溶液,备用。

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