• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        双 PAG 法

        最新修订时间:

        原理

        免疫金银染色方法敏感、简便、省时、安全可靠,葡萄球菌 A 蛋白(SPA)金标记四步法是在此基础上发展起来的更为敏感的一种新方法。SPA 和许多哺乳类动物 IgG 具有亲和性,且它们之间的连接不会干扰抗原-抗体的结合。简单的 SPA 金标记二步法后,第三步用抗 SPA 与 SPA 金表面分子通过 Fab 或 Fc 段相结合,结果结合更多的胶体金颗粒,再通过银增强,使原始信号得到几何级放大,其染色原理见图 6-9。

        材料与仪器

        步骤

        1. 石蜡切片常规脱蜡至水,0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 3×3 min。


        2. 0.1% 胰蛋白酶 37℃ 消化 20 min,或抗原修复 20 min(98℃),自然冷却至室温。


        3. 0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 3×3 min。


        4. 1% EA(卵蛋白)15 min,不洗。


        5. 适当稀释的特异抗体室温 4 h 或 4℃ 孵育 20 h,或 37℃ 孵育 1 h。


        6. 0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 3×5 min。


        7. 0.02mol/L(pH 7.4)TBS(内含 0.1% BSA)洗 10 min。


        8. 1% EA 15 min,不洗,滴加 PAG 10 nm 1:40 稀释,室温 1 h,或 37℃ 孵育 30 min。


        9. 0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 10 min。


        10. 兔抗 SPA IgG 1:400 稀释,37℃ 30 min。


        11. 0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 10 min。


        12. 滴加 PAG 10nm 1:60 稀释,室温 1 h,或 37℃ 30 min。


        13. 0.05 mol/L(pH 7.4)TBS 洗 10 min。


        14. 1% 戊二醛洗 10 min。


        15. 双蒸水洗 5 min。


        16. 1% 明胶洗 5 min。


        17. 银避光显影 8~15 mm。


        18. 双蒸水洗 15 min。


        19. 固定:用显影定影液(1:4 或 1:10)固定 5 min,也可以用 15% 硫酸钠-20% 硫代硫酸钠混合液固定 1~3 min,或用 1% 戊二醛固定 5 min,50℃ 温水洗 3~6 min。


        20. 衬染:核固红衬染 3 min 或甲基绿衬染 3 min。


        21. 常规脱水,树胶封片。


        22. 镜检:阳性物质呈黑色或黑褐色,颗粒分布于抗原-抗体反应部位;背景较干净,呈红色。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序