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        肽链交联

        相关实验:磷酸交联 AFFI-GEL 10 亲和介质实验

        最新修订时间:

        原理

        本方案描述了将磷酸肽链或非磷酸肽链交联到 Affi-Gel 10 亲和介质上以利用亲和柱层析法纯化抗体的方法。这里所详述的无水交联法是最有效的肽链交联方法。按此法的步骤最终能产生 3 ml 柱床体积的亲和树脂;每毫升Affi-Gel 10上能交联 3 μl 肽。

        材料与仪器

        步骤

        1. 用 0. 5~4 倍柱床体积的 DMSO 溶解肽。


        2. 如下滴定中和肽溶液:每次滴加 1~2 μl 肽合成级的 N-甲基吗啉(原液或以 1:1 至 1:9 稀释于 DMSO 中),然后取出 2~3 μl 稀释于50 μl 水中,滴加到 pH 试纸上。


        重复上述操作直至 pH 为 7~8。


        滴定要仔细,因为很容易超过所需的 pH 范围。一般每 3 μmol 肽需要用 7~8 μl N-甲基吗啉滴定,具体的量主要取决于特定的氨基酸序列。取出的等份必须与水混合再测 pH,因为 pH 是测量氢离子的浓度,因此非水溶液无法测量 pH。


        3. 将装有 Affi-Gel 10 介质的瓶子摇荡混合以使树脂充分悬浮,取需要量的树脂到带螺口盖的聚丙烯离心管,用 DMSO 洗3次,每次于室温以 700 g 离心 5 min ,吸去上清,重悬于5倍体积的 DMSO 中,然后再次 700 g 离心。


        4 . 从树脂上吸取多余的 DMSO,加入步骤 2 配制的肽溶液。室温下旋转混合孵育过夜。


        5. 每毫升树脂加入2 μl 乙醇胺,室温下旋转混合孵育 2 h。


        6. 按步骤 3 的方法用 DMSO 洗 2 次。


        7. 按步骤 3 的方法用 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl,pH 8.0 洗 2 次(第一次洗涤在冰上操作,因为会产生大量的热量)。第二次洗漆后,吸去洗涤液,换上新鲜的 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl 并于 4℃ 旋转混合孵育过夜。然后低速离心,吸去上清。


        8. 按步骤 3 的方法用高盐/高 pH 溶液洗 3 次。


        9. 按步骤 3 的方法用高盐/低 pH 溶液洗 3 次。


        10. 按步骤 3 的方法用 PBS/叠氮化物溶液洗3次,然后将洗过的树脂储存在 4℃ 以备装填柱子。


        11. 用 0.5 mol/L NaCl 将介质制成悬浮液,倒入玻璃层析柱。


        12. 依次用 10 倍柱体积的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱体积的 PBS/叠氮化物溶液洗柱。


        注意事项

        确保至少吸取所需体积两倍量的Affi-Gel 10,因为体积会缩减。所买的树脂一般是50% 的悬浮液,因此必需取所需柱床体积 4 倍的量。不要以高过推荐的速度离心,因为这样会损坏树脂。

        来源:丁香实验

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