磷酸酪氨酸交联

磷酸酪氨酸在肽交联时所用的无水条件下是不溶的，因此交联必须在水相条件下进行。按此节的步骤最终能产生 10 ml 柱床体积的亲和树脂；与肽类似，每毫升 Affi-Gel 10上能交联 3 μmol 磷酸酪氨酸。

1. 用 0.5～4 倍柱床体积的 0.4 % 碳酸氢钠溶解磷酸酪氨酸。

2. 用 pH 试纸检查 pH 是否在 7～8 的范围内。如果需要调节 pH，用滴定的方法来进行中和，即加入少量的 1 mol/L NaOH，吸取 2～3 滴到 pH 试纸上测量，重复上述操作直到 pH 为7～8。

3. 将装有 Affi-Gel 10 介质的瓶子摇荡混合以使树脂充分悬浮，取需要量的树脂转移到连有真空吸液器的多孔玻璃漏斗里。洗 3 次，每次将冷的蒸馏水倒在漏斗里的树脂上，然后真空吸去液体。最后以相同的方法用冰冷的 0.4% 碳酸氢钠洗 1 次。

4. 通过真空吸液去除树脂上多余的液体，但不要使树脂完全变干。将树脂移入带螺口盖的离心管，加入步骤 2 中配制的磷酸酪氨酸溶液。

5. 4℃ 旋转混合孵育过夜。

6. 每毫升树脂加入 2 μl 乙醇胺，室温下旋转混合孵育 2 h。

7. 洗涤树脂 2 次，每次低速离心（见「肽链交联」步骤 3），吸去上清，重悬于 5 倍体积的 0.4% 碳酸氢钠，再次低速离心。

8. 按步骤 7 的方法用 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl，pH 8.0 洗 2 次。第二次洗涤后，吸去洗涤液，换上新鲜的 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl 并于 4℃ 旋转混合孵育过夜。然后低速离心，吸去上清。

9. 洗涤，储存，填装柱子（见「肽链交联」步骤 8～12）。

确保至少吸取所需体积两倍量的 Affi-Gel 10，因为体积会缩减。所买的树脂一般是 50% 的悬浮液，因此必需取所需柱床体积的四倍的量。树脂从瓶中取出到树脂与磷酸酪氨酸溶液混合之间的时间不要超过 20 min。