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        基本方案

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        实验所需「试剂」具体见「其他」


        1. 包被抗原


        用套有橡皮吸头的 0.2 ml 吸管小心吸取用包被液稀释好的抗原,沿孔壁准确滴加 0.1 ml 至每个塑料板孔中,防止气泡产生,置 37℃ 过夜。


        2. 清洗


        快速甩动塑料板,倒出包被液。用另一根吸管吸取洗涤液,加入板孔中,洗涤液量以加满但不溢出板孔为宜。室温放 3 min,甩出洗涤液。再加洗涤液,重复上述操作三次。


        3. 加血淸


        用三根套有橡皮吸头的 0.2 ml 吸管,小心吸取稀释好的血淸(待检、阳性、阴性血清),准确加 0.1 ml 于对应板孔中,第 4 孔中加 0.1 ml 洗涤液,37℃ 放置 10 min 在水池边甩出血清,洗涤液洗三次(方法同上)。


        4. 加酶标抗体


        用吸管沿孔壁上部小心准确加入 0.1 ml 酶标抗体(不能让血清沾污吸管),37℃ 放置 10 min,同上倒空,洗涤三次。


        5. 加底物


        按比例加 H2O2 于配制的底物溶液中,立即用吸管吸取此种溶液,分别加于板孔中,每孔 0.1 ml。 置 37℃,显色 5~15 min(经常观察),待阳性对照有明显颜色后,立即加一滴 2 mol/L H2SO4 终止反应。


        6. 判断结果


        肉眼观察(白色背景),阳性对照孔应明显黄色,阴性孔应无色或微黄色,待测孔颜色深于阳性对照孔则为阳性;若测光密度,酶标测定仪取 λ=492nm,P/n>2.1 时阳性,P/n<1.5 阴性,2.1>P/n>1.5可疑阳性,应予复査,P/n=(检测孔 O.D. 值)/(阴性孔 O.D. 值)(用空白孔校 T=100%)。


        滴加试剂量要准,且试剂不可从一孔流到另一孔中,每种试剂对应一种吸管,不能混淆,底物溶液中的 H2O2 要临时用再加。否则,放置时间过长,底物被氧化为黄色,影响试验结果判定。

        注意事项

        在操作过程中切记溢出互混。

        常见问题

        试剂:


        1. 包被液(0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液):甲液:Na2CO3,5.3 g/L,乙液:NaHCO3,4.2 g/L,取甲液 3.5 份加乙液 6.5 份混合即成,现用现混。


        2. 洗涤液(吐温酸盐缓冲液 pH 7.4):NaCl 8 g,KH2PO4 0.2 g,Na2HPO4·12 H2O 2.9 g,KCl 2 g,吐温 20 0.5 ml,蒸馏水加至 100 ml。


        3. pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液:柠檬酸(19.2 g/L)24.3 ml,0.2 mol/L 磷酸盐溶液(28.4 g Na2HPO4/L)25.7 ml 两者混合后再加蒸馏水 50 ml。


        4. 底物溶液:100 ml pH 5.0 磷酸盐—柠檬酸缓冲液加邻苯二胺 40 mg 用时再加 30% H2O2,0.2 ml。


        5. 终止液 2 mol/L H2SO4


        6. 酶结合物冻存液的母液:0.02mol/L PBS pH 7.4,即(1)K2HPO4·3H2O 1.83 g 加蒸馏水至 400 ml,(2)Na2HPO4·2H2O,312 g,加蒸饱水至 100 ml,(1):(2)=81:19 混合。


        7. 应用液:0.02mol/L PBS pH 7.4,60 ml+40 ml 甘油+万分之一的疏柳汞(也可不加)配成 40% 甘油液,即为酶结合物冻存液。

        来源:丁香实验

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