备择方案 含 GST 标签

1. 制备澄清的重组蛋白溶液（见基本方案步骤1～5)。

2. 轻轻的重悬谷胱甘肽琼脂糖珠，将其倒入适当的层析柱中，使树脂自然沉降，柱中液体流尽，然后用 3～5 倍的 PBS 洗涤缓冲液洗柱 2 次，以去除附着的乙醇。让柱中液体流尽。

3. 将澄清的重组蛋白溶液上柱，调整柱的流速至最大为 5 ml/min 每 ml 琼脂糖珠。保存每份流出液，进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，防止超出了谷胱甘肽的结合能力。

4. 用 5 倍床体积的 PBS 洗涤缓冲液洗柱，让柱中液体流尽，弃洗液。

5. 将 3 倍床体积的 GST 洗脱缓冲液上柱。调至最大流速为5 ml/min每ml琼脂糖珠。让柱中液体流尽，分别收集洗脱液。可选择加入 150 mmol/L 的 NaCl、5 mmol/L CaCl₂（或对于有些蛋白质为 5 mmol/L MgCl₂）和 0.1% 2-巯基乙醇，这对某些蛋白质的可溶性是需要的。

6. 将自由的谷胱甘肽在 100 倍体积的 50 mmol/L Tris · Cl（pH 8.0），4°C透析 >4 h。2 h后更换透析液。

7. 每毫克含有凝血酶酶切位点的纯化 GST 或 6 × His 融合蛋白加入 200 μg（10 个凝血酶单位）牛凝血酶。

8. 混合，在室温下放置 12 h 以上。

9. 在酶切反应结束后，加入 2 倍体积 50% 的谷胱甘肽琼脂糖珠。

10. 4℃，放置 30 min。4℃，5000 g 离心 10 min。将上清放在 -80℃ 保存。

上清含有纯化的蛋白质和凝血酶可保存在 -80℃，—些蛋白质需加BSA或甘油（终浓度50％）以保持稳定。