• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        溴化乙锭染色法

        最新修订时间:

        原理

        如果将微生物细胞裂解,使其拟核(即染色体 DNA)被抽提出来,通过溴化乙淀(ethidium bromide,简称 EB)染色并进行琼脂糖凝胶电泳,便可观察到释放到细胞外的染色体 DNA。EB 是一种扁平分子染料。可特异性插入 DNA 碱基对之间,在紫外线照射下,使 DNA 呈现荧光,因而可观察到凝胶中的染色体 DNA,由于在提取过程中大分子染色体 DNA 的随机断裂,所以经凝胶电泳后形成的是一条不整齐的浓的荧光带。

        用 EB 染色法进行的体外观察染色体 DNA 也分两步进行:

        1. 将细胞裂解后抽提染色体 DNA;

        2. 通过含有 EB 的琼脂糖凝胶电泳在紫外光下观察染色体 DNA 荧光带。

        材料与仪器

        步骤

        1. 取 4.5 ml 大肠杆菌过夜培养液于 5 ml 塑料离心管中,12000 r/min 离心 1~2 min,弃上清。


        2. 将细胞沉淀悬浮于 1.7 ml TE 缓冲液中,加入 10% SDS 90 μl 和 20 mg/ml 的蛋白酶 K 9 μl 混匀,37℃ 保湿 1 h。


        3. 加入 5 mol/L NaCl 300 μl,充分混匀,再加入 240 μl CTAB/NaCl,混匀,置 65℃ 水浴 10 min。


        4. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀,12000 r/min 离心 5 min。


        5. 将上清水相转入另一洁净的塑料离心管中,加 0.6 倍体积的异丙醇使 DNA 沉淀下来。


        6. 快速离心数秒钟,弃上清,用 70% 的乙醇淋洗 DNA 2 次,将 DNA 沉淀经真空干燥后溶于 300 μl TE 缓冲液中。

        用此法获得的染色体 DNA 可用于限制性酶切等分子生物学操作。


        7. 取少量(约 3~5 μl)提取的 DNA 样品(其余置于-20℃ 保存),加入 3 μl 溴酚蓝加样缓冲液,混匀后上样进行琼脂糖凝胶电泳 1 ~ 2 h。琼脂糖中加有 EB,在电泳过程中,EB 将插入 DNA 分子中。


        8. 戴上一次性塑料手套(EB 是强诱变剂)将凝胶取出置于紫外分析仪上观察染色体 DNA 荧光带。


        注意事项

        必须通过一块普通玻璃或戴上防护眼镜进行现察,以免损伤眼晴。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序