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        四、cDNA 的克隆及测序

        相关实验:cDNA 法推断蛋白质的一级结构实验

        最新修订时间:

        原理


        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. cDNA 片段与载体进行联接反应(多在 4℃下进行低温联接);


        2. 使用两次 CaCl2 沉淀法制成的感受态细菌(如 DH5a 或 Jm 109 等菌株),进行转化;


        3. 结合载体抗生素抗性特点,进行菌落的蓝白斑筛选;


        4. 单个菌落的扩增培养及质粒的提取,酶切鉴定;


        5. 阳性质粒的纯化及序列测定;


        6. cDNA 序列的测定:现在多使用核酸自动测序仪来进行序列的测定。使用仪器多为 PE 公司的 337 型自动测序仪。这种仪器一个反应可以读出约 700 bp 长的核酸序列,正确率在 90% 以上, 一个反应的成本约在 100 元(人民币)左右。由专业人员进行的测序一般可以保证正确率达到 95% 以但要完全正确的读出序列。则需通读双链,并进行技术性分析及纠错才可得到。一般认为,在技术完善的情况下,影响测序的因素主要适 cDNA 本身的结构,如 G 和 C 含量过高,序列的一端有 polyT 结构等。

        来源:丁香实验

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