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        间充质干细胞(MSCs)的传代培养

        相关实验:MSCs 培养物的扩增和冻存实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        (a)检査所得的MSCs。如果培养物中小的、贴壁、纺锤形的成纤维细胞样细胞汇合至60%时,对其进行处理。如果单层细胞稀疏,继续润洗和更换培养基。


        (b)按如下步骤消化单层细胞:用20 mL预热的PBSA润洗单层细胞后,加人5mL胰蛋白酶/EDTA。将培养皿置于37℃ 2min,在1O×放大倍数视野下观察单层细胞。贴壁细胞应正从塑料培养瓶上脱落。将培养皿置于37℃ 2min,再次观察。重复观察直到90%的MSCs已从培养瓶中脱落下来。加人5mL CCM,将10mL悬液移至15 mL离心管中,500g离心10 min。离心完毕,弃去上清,每管用1〜2mL预热的PBSA重悬沉淀。如有必要,混合多管细胞悬液只进行一次细胞计数。


        (C)取10μL细胞悬液加人到10μL台盼蓝中,用血细胞计数器进行计数。合适的细胞悬液浓度为(2〜5)×105个细胞/mL,存活率需高于80%。胰蛋白酶消化后用于传代的早期培养物悬液,亦可进行集落形成单位(CFU)测定、冻存或分化测定。


        (d)将细胞以50〜100个细胞/cm的密度接种到培养皿中,保持低密度以保证快速的自我更新和多潜能特性。用预热CCM以7×103(最终密度为50个细胞/cm2)到1×104(最终密度为100个细胞/cm2)的密度重悬MSCs。


        (e)预备适当数量的15 cm培养皿,加人25 mL预热的CCM。


        (f)接种1 mL步骤(b)和(c)所得的细胞悬液。来回滑动平皿(勿打圈)使细胞分布均匀。培养皿置于培养箱中,标记为一代细胞。


        (g)培养2〜3天后,观察并评价形态。MSCs应为小的、纺锤体形状,频繁折光的双联体。此为培养良好的MSCs。


        (h)从培养皿中吸出培养基,用20 mL预热的PBSA润洗,加入25 mL预热的新鲜CCM。


        (i)每次传代时所需的培养皿数量取决于可以接种的细胞数量。方案中的上述体积适用于MSCs接种至单个15 cm培养皿。如有需要可按此例扩大以接种多个培养皿。

        来源:丁香实验

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