基本方案直接分析

相关实验：凝胶中激酶直接分析实验

最新修订时间：2024-05-13

原理

盐酸胍或脲都能使蛋白质变性，选用哪一种取决于不同的激酶，但一般首选盐酸胍，因为对大多数激酶而言它的变性效果更好。

材料与仪器

实验材料	有激酶活性的酶样品 10 mmol L 激酶底物
试剂、试剂盒	Tween 20 脲 [γ-32P] ATP 盐酸胍 DTT 焦磷酸钠 2-丙醇匹配的激酶反应缓冲液 Mg／ATP 溶液 Tris•Cl 三氯乙酸（TCA）
仪器、耗材	放射性物质专用温浴器（如带有紧盖的小盘和可热密封的聚乙烯袋密封仪（选用））

步骤

1. 按适当百分比浓度制备聚丙烯酰胺分离胶，加入 10 mg/ml 激酶底物，使其在分离胶混合液中的终浓度达到 1 mg/ml。均匀混合后浇入制胶装置使其聚合。

2. 按通常的方法制备有激酶活性样品的 SDS-PAGE 电泳样品，电泳。

3. 电泳完毕后将胶放入 200 ml 20 %（V/V）2-丙醇/ 50 mmol/L Tris•Cl，pH 8.0 的洗液中，漂洗 20 min，换入新的缓冲液，再重复 2 次。

4. 用 200 ml 的 1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl pH 8.0 洗 3 次，每次 20 min。

5. 用 250 ml 的 6 mol/L 盐酸胍 /1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl pH 8. 0 或 8 mol/L 脲/1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl pH 8.0 洗 2 次，每次 30 min。

6. 在 18 h 以上的周期内用 250 ml 的 1 mmol/L DTT/0.05 %（V/V）Tween 20/50 mmol/L Tris•Cl（pH 8.0）的溶液，4℃，洗 8～10 次，使蛋白质充分复性。

7. 将胶放入 250 ml 与激酶匹配的反应缓冲液中（含 10 mmol/L MgCl₂），30℃，温浴 20 min。

8. 移走所有残存缓冲液，将胶放入带有密封盖的容器或可热密封的聚乙烯袋（容器应为放射性物质专用）。加入尽量少的激酶反应缓冲液，以正好覆盖胶面为准。加 1/4 反应缓冲液容积的 10 mmol/L Mg/ATP 溶液（终浓度 50 μmol/L ATP），最后加入 20 μCi/ml [γ-³²P] ATP。

9. 30℃，温浴 1 h。

10. 在 250 ml 的 5 % TCA 中将胶浸泡 15 min，重复一次。在 500 ml 1 % 焦磷酸钠/ 5 % TCA 中洗胶，重复洗涤，直至洗液几乎不含放射性物质。

11. 在滤纸上使胶干燥，放射自显影。

注意事项

因为样品具有放射性，在样品制备和转移过程中应多加小心。相关的反应和操作应在带有螺旋盖的微量离心管中进行，以减少 ³²P 的放射性污染危害。在电泳时，必须待染料转移出胶后方可进行下一步操作，因为这样可使残留的 [γ-³²P] ATP 伴随染料从胶中转移出去，这也意味着在电泳缓冲液中含有 ³²P，因此应将其按放射性废液的安全处理原则妥善处理。

常见问题

材料：

10 mmol/L 激酶底物，如髓鞘碱性蛋白

有激酶活性的酶样品（见用于激酶分析的细胞裂解实验），保持冰浴

试剂：

20%（V/V）2-丙醇／50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8.0）

1 mmol/L DTT / 50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8. 0）

6 mol/L 盐酸胍/ 1 mmol/L DTT / 50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8.0）或 8mol/L 脲/1 mmol/L DTT/50 mmol/L Tris • Cl（室温下 pH 8.0）

1 mmol/L DTT/0. 05%（V/V）Tween 20 /50 mmol/L Tris • Cl（4℃，pH 8.0）

匹配的激酶反应缓冲液

10 mmol/L Mg/ATP 溶液

10 mCi/ml [γ-³²P] ATP（3000 Ci/mmol； Amersham， DuPont NEN 或 ICN Biomedicals）