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        从重组溶源菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性

        相关实验:编码 DNA 结合蛋白的 cDNA 克隆的检测、纯化和鉴定

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1) 37℃在LB/麦芽糖/氨苄青霉素培养液中培养大肠杆菌Y1089 hflA150生长至饱和。


        2) 用LB/MgCl2培养液将细菌悬液稀释100倍,取100μL用5μL 1010pfu/mL λgtll重组噬菌体液感染,32℃温育。


        3) 用LB培养液将被感染的细菌悬液稀释1000倍。取100μL涂于LB/氨苄青霉素平板上,32℃温育过夜,每平板可获得约100个菌落。


        4) 试验单个菌落的温度敏感生长情况。用消毒牙签将各单菌落分别点种于2块LB/氨苄青霉素平板上。将其中1块置于42℃温育,另1块置于32℃温育。


        能在32℃而不能在42℃生长的菌落为溶源菌,其出现频率应为10%〜80%。


        5) 在LB/氨苄青霉素培养液中将重组噬菌体溶源菌于32℃培养过夜。


        6) 取20μL过夜培养物接种于2 mL LB/氨苄青霉素培养液中。于32℃在有良好通风的情况下培养。


        7) 当OD690=0.5 (约3 h)时,将温度调至44℃,培养20 min。


        8) 加1 mol/L IPTG至终浓度为10 mmol/L,温度降低至37℃,继续培养1 h。


        9) 取1 mL经诱导的培养物在室温下离心45 s。


        10) 将沉淀重悬于100μL抽提缓冲液中,迅速在干冰/乙醇中冻结。如果需要,于-70℃保存细胞悬液。


        11) 快速解冻细胞悬液。加5 mg/mL溶菌酶至终浓度0.5 mg/mL。在冰上放置15 min。


        12) 加4 mol/L NaCl至终浓度1 mol/L,并彻底混匀。4℃在旋转式混合仪上温育15 min


        13) 4℃离心30min,小心移出上清。


        14) 将上清置于0.025μm的圆盘滤膜上,对100 mL抽提液4℃透析60 min。然后在干冰/乙醇浴中迅速冻结,并保存于-70℃。

        来源:丁香实验

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