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        备择方案 1 对贴壁细胞

        相关实验:氨基酸代谢标记实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 在 100 mm 组织培养皿中培养细胞到 80%~90% 融合(0.5 × 107~2 × 107 细胞,取决于细胞类型)。


        2. 如上所述制备 [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见基本方案步骤 1)。


        3. 吸弃上清并用 10 ml 预热(37℃)脉冲标记培养基轻柔洗细胞 2 次,弃掉洗液。


        4. 加 5 ml 预热脉冲标记培养基,在潮湿、37℃、5% CO2 培养箱内孵育 15 min,以除去细胞内的甲硫氨酸。


        5. 弃掉细胞上的培养基,加入 2 ml [35S] 甲硫氨酸的工作液体(见步骤 2),在 CO2 培养箱内孵育 10~30 min。


        6. 弃掉细胞上的培养基。用 10 ml 冷冻的 PBS 洗细胞并弃掉 PBS。加 10 ml 冷冻的 PBS,并用塑料刮子或橡胶细胞刮小心刮取收集细胞。


        7. 转移悬液到 15 ml 离心管中,4℃,300 g 离心 5 min,弃上清。如果在标记过程中细胞明显脱落,有必要将含有 [35S] 甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取,并将悬液转移到 15 ml 离心管中,在用 PBS 洗涤前离心。


        8. 可选:通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量(见辅助方案)。


        注意事项

        如果在标记过程中细胞明显脱落,有必要将含有[35S]甲硫氨酸的工作液中的细胞小心刮取, 并将悬液转移到15 ml离心管中,在用PBS洗涤前离心。

        常见问题

        1. 实验材料中贴壁细胞,如 HeLa、NRK、Ml、COS - 1、CV - 1,或原代培养的成纤维细胞或内皮细胞。

        2. 如果细胞沉淀不马上使用的话,见基本方案步骤7。

        来源:丁香实验

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