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        备择方案 2 示踪标记细胞

        相关实验:氨基酸代谢标记实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 每个时间点和每个样品准备 0.5 × 107 ~2 × 107 细胞, 每 0 .5 × 107 ~2 × 107 细胞用 2 ml 0.1~0.2 mCi/ml [35S] 甲硫氨酸脉冲标记 10~30 min (见基本方案步骤 1~4,或见备择方案 1 步骤 1~5)。


        2. 去除 [35S] 甲硫氨酸的工作溶液,用 10 ml 37℃ 的示踪培养基洗一次,并加入 10 ml 37℃ 的示踪培养基。


        3. 37℃ 培养到预期时间。拧紧试管盖子在旋转情况下培养细胞悬液。在 032 培养箱里孵育贴壁细胞。


        4. 刮取贴壁细胞并转移到 15 ml 离心管。收集刮取的细胞或细胞悬浮液于 4℃ 300 g 离心 5 min。


        5. 可选:通过 TCA 沉淀法测定标记掺入的量(见辅助方案)。

        注意事项

        1. 将2倍体积含有过量未标记甲硫氨酸(15mg/L)的示踪培养基直接加入到标记混合物中,能够快速终止标记反应。

        2. 示踪≤2 h,细胞悬液的最终浓度应该是 2 × 106 细胞/ml,或示踪>2 h,用 0.5 × 106 细胞/ml。 对贴壁细胞而言,加 10 ml/100 mm 平皿。

        常见问题

        1. 上清可以弃掉,也可以收集起来用于分析分泌或脱落到培养基中的蛋白质。

        2. 如果细胞沉淀不马上使用的话,见基本方案步骤7。

        来源:丁香实验

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