技术和方案24 挑取合子

传统筛选合子的方法是将接合混合物涂布在选择平板上，二倍体细胞能生长，而单倍体细胞不能生长。合子的形态学特点使我们有可能从接合的单倍体细胞群体中将它识别出来，利用显微操作平台使我们很容易从未接合的细胞中分离合子。

如果单倍体细胞都是新鲜培养物，接合效果最好，一般从 30°C 培养 1~2 天的平板上收集的细胞接合的效果都较好。非新鲜培养的细胞包括在 4°C 放置几天的细胞也可以接合，但形成合子的时间会长于新鲜的培养物。

1.用无菌的牙签分别挑取等量的 MATa 和 MATa 细胞（大小为 1~2 mm) 于 YPD 平板上，彼此毗邻，然后将它们混匀，形成约直径 5 mm 的菌落。

2.在 30°C 培养平板 3 h。

3.用无菌牙签挑取接合混合物样品，在平板的表面画线。当平板用显微镜观察时，单个细胞就可以区分。

4.合子通过细胞间的融合，而单倍体细胞因为响应接合信息素而停止生长。合子会呈哑铃状，容易和大的出芽单倍体细胞混淆。中间出芽的合子会有独特的三叶形状，因而很容易从接合混合物中分辨出来。

5.用技术和方案 22 的方法，用显微针将合子分离至干净的区域。

6.在 30°C 培养平板 1~2 天。

7.为了确定分出的细胞的确是二倍体细胞，将它们影印在选择平板上。如果两种单倍体细胞没有明确的遗传标记，用接合测试法则（实验二）来确定细胞是否发生接合，正确的接合型是 MATa/MAL 二倍体。