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        技术和方案17 细胞同步化

        相关实验：酵母遗传学方法实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        有时需要生长同步化或者停滞在细胞周期的一个特定时点的酵母群体。获得同步化 的方法之一，是使用在细胞分裂周期中停滞在特定时间点的温度敏感突变株；然而，这 需要为各个实验构建特定的菌株，可选的方法是使用药物或抑制剂在细胞周期中阻滞 细胞。 技术和方案1 7 细胞同步化 程序 a 因子 M A T a细胞由于应答十三肽配型激素《因子将停滞在细胞周期的开始。十三肽配型 激素a 因 子 （Sigma T 6901)可 买 市 售 商 品 lm g/m l的 PBS肽 溶 液 在 一20°C 储存。 M A T a细胞产生一种蛋白酶B a rlp 可以破坏a 因子；因此，成功地使用《因子使细胞同 步化需要判断B a rlp 的活性。同步化的程度可以从细胞被《因子阻滞后的锥形形态判 断。以下列出了三种方法。 细胞浓度稀释法 1 ) 用 YPD 培养细胞密度至107 个/m l。 2 ) 离心收集细胞，用无菌水洗二次除去B arlp。 3 ) 悬浮细胞在Y P D 中至细胞密度为104 个/m l，添加a 因子至2mg/m l。 4 ) 培养细胞至两代代时。 5 ) 离心收集细胞，判断阻滞细胞的比例。 降 低 pH 法 B a rlp 的活性是p H 依赖的，在 低 p H 能部分抑制。 1 ) 用 YPD培养细胞至密度为107 个/m l。 2 ) 离心收集细胞，用无菌水洗两次细胞除去B arlp。 3 ) 悬浮细胞在YP D 中至细胞密度为106个/m l，添加a 因子至2哗/1111。 4 ) 培养细胞至两代代时。 5 ) 判断阻滞细胞的比例。 使 用 B ari突变菌株 1 ) 用 YPD 培养细胞至密度为107 个/m l。 2 ) 添加a 因子至50ng/m l。 3 ) 培养细胞至两代代时。 4 ) 判断阻滞细胞的比例
        重新进入细胞周期 为了终止a 因子诱导的阻滞，离心细胞用水洗两次。重悬细胞在含有5(Vg/m l孔 酶的溶液中。 羟基脲 羟基脲是核糖苷还原酶的抑制物。细胞在抑制物存在时不能合成脱氧核糖核苷因而 不能合成DN A。用抑制剂处理细胞会使一群细胞阻滞在S 期早期。抑制剂阻滞的细胞 有大的芽、 单个未分裂的核和短的有丝分裂纺锤体。抑制剂的效应容易逆转。 1 ) 用 YPD培养细胞至密度为107 个/m l。 2 ) 添加抑制剂至终浓度为0. 2mol/L 。 3 ) 生长细胞至两代代时。 4 ) 判断阻滞细胞的比例。 重新进入细胞周期 为了终止抑制剂诱导的阻滞，离心细胞，用水洗两次。重悬细胞在适当的溶液中。 Noaxkzole是微管装配的抑制剂，在抑制剂存在时，细胞不能有丝分裂。用抑制剂处 理细胞会使一群细胞阻滞在M 期 。抑制剂阻滞的细胞有大的芽、 单个未分裂的核、 没 有有丝分裂纺锤体。核不是定位在颈处，而是随机分布。抑制剂的效应容易逆转。 1 ) 用 YPD培养细胞至密度为107 个/ml。 2 ) 添 加 10M1溶 于 DMSO浓度为1. 5mg/m l的储存液。 3 ) 培养细胞至两代代时。 4 ) 判断阻滞细胞的比例。 重新进入细胞周期 为了终止抑制剂诱导的阻滞，离心细胞，用水洗两次。重悬细胞在适当的溶液中。 平台期 细胞进人平台期，从而暂时退出细胞周期。平台期的细胞被稀释进新鲜培养基时， 将重新慢慢地进人细胞周期。然而，同步化依赖前期的培养条件和菌株。在采用这种方 法前要仔细地测试。 1 ) 接种细胞在含棉籽糖不含葡萄糖的Y P 培养基中，至细胞密度大约为104 个/m l。在 30°C ，不断通气， 300r/min 振荡培养48h。为了优化通气，培养物体积要为培养瓶 体积的1 0 % 。 2 ) 离心收集细胞，用 YPD培养基重悬细胞至密度为5X 106 个/ml。 为了优化通气，培 养体积要为培养瓶体积的1 0 % 。 每 15min取样判断同步化和有小芽阻滞细胞的比 例。大 约 8 0 % 的细胞在延迟60〜90min后 ，在 15min的间隔内会出芽。

        来源：丁香实验

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