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        技术和方案12 酵母免疫荧光法

        相关实验：酵母遗传学方法实验

        最新修订时间：

        材料与仪器

        步骤

        丽 该方法根据1989年 Pringle等提出的方案改编。 安全须知 甲 醛 有 毒 、 可挥发并且是一种致癌物，它可以通过皮肤吸收，对眼睛、 皮肤、 黏膜和 上呼吸道有刺激性，应避免吸入其蒸气。使用时需要戴手套、安全眼镜，始终保持在化 学通风橱里操作，远离热源、 火星和明火。 4, 6-二脒基-2-二苯基吲哚（ DAPI) 能致癌。吸入、 吞咽或皮肤吸收有害，也能引起炎 症。勿吸人其粉尘或气体，戴好手套及防护镜在通风橱中操作。 固定液中的苯二胺有毒和潜在的致癌性。吸入、 吞咽或皮肤吸收有害，戴好手套及防护 镜在通风橱中操作。 细胞处理 1 ) 用 250ml YPD 液体培养基在适当的温度培养细胞至密度为2 X 107 个/m l。加 17ml 浓度为1 0 % 的甲醛至终浓度为4 % ; 在细胞生长温度，振摇温育细胞lOmin。 2) 2000r/m in 离 心 细 胞 3m in，去上清后悬浮细胞在6m l固 定 缓 冲 液 中 （40mmol/L KP0 4 pH6. 5、 50(Vmol/LM gC l2、 1 0 % 甲醛 4m l) 在 30°C孵化 lh 。 3 ) 用 不 含 甲 醒 的 固 定 缓 冲 液 （40mmol/LK P O 4 pH6.5、 500jumol/LM gC l2、 补水 至 6m l) 洗细胞，两次；用 含 1.2mol/L 山梨醇的固定缓冲液洗一次细胞。洗时 动作要轻柔。重 悬 细 胞 在 0.5m l的山梨醇缓冲液中，此 时 ，细 胞 能 够 在 4°C 保 存过夜。 4 ) 在 37°C ，用消解酶30|u l处理细胞5〜30m in，用相差显微镜观察细胞，如果细胞为 黑色且形状不规则，可能是处理过度；如果细胞明亮且有折光，可能处理的时间不 够 ；如果细胞形态很好且呈深灰色，处理的程度正好。因为这一步是操作中最易变 的，也是最重要的一步，我们建议做时间相关性曲线比较消解酶处理细胞和未处理 细胞，来判断处理条件。 5 ) 用山梨醇缓冲液洗细胞一次后，悬浮细胞在100〜500^1的山梨醇缓冲液中。 注意： 轻轻地摇动重悬细胞，置于冰上。 玻片制作 6 ) 用 2 ( ^ 1 1 % 的多聚赖氨酸（ 相对分子质量>40 0 0 0 0 ) 包被特氟隆面载玻片的小室， 室温温育lOmin。多聚赖氨酸溶液使用前要高速离心lOmin，以除去杂质和细小颗 粒，不要使用管底的溶液。总之，所有的试剂使用前都要高速离心以去除杂质和不
        溶物。要在湿盒中温育玻片。 7 ) 用20卩1纯水洗5 次玻片小室并风干，要保持清洁。 8 ) 加 2(^1细胞悬液到小室中，室温温育lOmin，每个样品平行做两份。吸去孔中的大 部分液体，将玻片插入装有冰冷甲醇的小瓶中6m in，再插入另一个装有冰冷丙酮的 小瓶中30s，为了保证小瓶和溶液足够冷，使用前用干冰冷冻2h 以上。要经常更换 甲醇或丙酮，不能使用乙醇。 9 ) 从丙酮中取出玻片，斜靠在平整、 干净、 温热的台架上，以便丙酮很好地蒸发而不 形成晕圈。拿玻片应戴好手套，防止油污等污染玻片。 细胞染色 10) 每小室加20jlJPBS (pH7.4、 0.5%BSA、 0 . 5 % 卵清白蛋白）封闭细胞。有时在封 闭液中加〇.5 % Tween-20能提高抗体结合的专一性。要注意的是Tween-20会降低 特氟隆的疏水性，样品有可能粘连。在湿盒中，室温温育lh ，也可以温育过夜。 11) 细胞在用封闭液适当稀释的抗体溶液中温育。最好做系列稀释抗体的预实验。在室 温温育lh 或更长时间，有时需要过夜。长时间温育有利于结合力弱的抗体更好地结 合抗原。 12) 每孔用20ju l的封闭液洗细胞，洗 5 次，每 次 lOmin。 13) 每孔加封闭液稀释的二抗溶液20W，于室温温育lh 。 二抗的使用浓度可以通过预 实验来决定。 14) 按步骤12洗细胞，吸去大部分洗液，立即加入一小滴封片液，盖上盖玻片。用擦 镜纸吸去玻片上多余的封片液，用指甲油封闭盖玻片的边缘。在观察以前，晾干的 玻片可以保存在一20°C 。玻片放在物镜下观察时，一定要彻底清除玻片上残存的封 片液，以免损坏物镜。 材料和试剂 消解酶100T 溶解消解酶在山梨醇磷酸缓冲液中，浓度为l 〇mg/m l。离心取上清转移到新管中， 用液氮速冻，然后储存在一80°C 。不要反复冻融。 聚合赖氨酸 用高相对分子质量的聚合赖氨酸（ 相对分子质量>300 000)配成1 % 的水溶液。 分 装成小份，液氮速冻后储存在一 80°C 。避免反复冻融。 4 > 6-__^脉基_2__^苯基n引噪 配 成 lm g/m l的水溶液储存在一20°C 。 固定液 溶 lOOmg的尹苯二胺在10ml PBS中，用 0. 5mol/L 碳酸钠缓冲液调节p H 至 8. 0， 加人甘油至100m l体积。加 入 4 ， 6_二脒基-2-二苯基卩引噪至50ng/m l，充分混合好，储 存在一80°C ，当固定液老化时，需重新配制。大多数抗体需要甲醇-丙酮混合液固定的 步骤以促进抗原表位的识别。然而，某些情况下可以省略此步，但需要在封闭液中加
        技术和方案12 酵母免疫荧光法

        来源：丁香实验

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