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    技术和方案11 酵母活细胞染色

    相关实验：酵母遗传学方法实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    A. DAPI染核和线粒体DNA 基 于 Pringle等 1989年提出的方法。 安全须知 D A P I 可能致癌。吸入、 吞人或经皮肤吸收是有害的，有刺激性。戴手套、 面罩和护 目镜操作，避免吸入粉尘。 1 ) 用离心管离心收集约1〇 7 个 细 胞 （5s —间歇），并重悬于7 0 % 的乙醇中。 2 ) 静置至少5m in，用水洗两次。 3 ) 用小体积的 50ng/m l DAPI (4、 6-二脉基-2-苯基卩引噪；Sigma D9542 或 Accurate Chemicaland Scietific Corp.) 悬浮 细 胞 。配 成 lm g/m l浓 度 的 水 溶 液 ，储存于 一20。。。 4 ) 用紫外滤光片观察。 用甲醛固定的细胞也能在封固剂中用D A P I染色。浓 度为l ^g /m l的 D A P I也可用 于生长培养基上的活细胞染色，但背景细胞的染色会强于被固定的细胞。在培养基中加 入 0. 1 % 的 Triton X-100 ( Sigma) 能改善染色效果。 B. 用 DiOC6 或 DiIC5(3)染色观察线粒体 基 于 Pringle等 1989年提出的方法。 细 胞 生 长 至 约 1〇7 个 时 ，加 人 DiOC6 (3, 3'-二 己 基 恶 羰 花 青 碘 化 物 ；Sigma D3652或 Molecular Probes)至终浓度为100ng/m l (lm g/m丨的乙醇储存液按1 : 104 稀 释 ，储存液在一2〇°C避光条件下能稳定保存数月），孵 育 5〜 lOmin，用荧光过滤装置 观察。 也可以用终浓度为l 〇〇ng/m l的 DiIC5 (3) (1， 1'-二戊基-3, 3, 3、 3^四甲基靛 羰花青碘化物；Molecular Probes) 染 色 （ 由 2. 5mg/m l的储存液用无水乙醇稀释），孵 育 5〜10m in后用红色滤光装置观察。 注意： 使 用 时 ^0(：6 和〇 11(：5 的浓度需要优化。例如，约 lp g /m l的浓度时所有的 膜都将被染上色。 C. 用 FM4-64染色观察液泡和吞噬腔隙 基 于 V ida和 E m r等 1996年提出的方法 1 ) 培 养 5m l酵母细胞到2X 107 个。
    2 ) 收 集 lm l细胞，重悬于20(V YPD。 3 ) 加入 2jul 8m m ol/L FM4-64 ( Molecular Probes # T-3166; 溶解 lm g 固体到 200^1 水 中，配 成 8mmol/L 的储存液）， 30°C避光孵育30〜60min。 4 ) 收集细胞，并 用 lm l YPD洗一次。 5 ) 重悬于lm l YPD， 30°C继续孵育20〜40min。 6 ) 用红色滤光装置检测。 FM4-64是一种亲脂性的苯乙烯基染料，被酵母通过吞噬途径吸收进入细胞。 FM4- 64能选择性地染色到酸性腔隙的膜上，适用于在脉冲实验或内吞突变体中观察内吞途 径。 实际上， Tom V id a 已将该方法用于筛选内吞突变体。 D.Calcofluor染色观察几丁质和芽痕 基 于 Pringle等 1989年的方法。 1 ) 细胞生长至约1〇 7 个时，加 人 Calcofluor (荧光增亮剂28; Sigma F3397)至终浓度 为 lOOjug/ml (lm g /m l的储存液按1 : 10稀释使用，储存液在一20°C避光能稳定储 存数周）。 2 ) 孵 育 5m in或更长些，用水洗两次后在D A P I兼容滤光装置下观察。 材料和试齐if 固定液 将 lOOmg对苯二胺溶解于10ml PBS中，用 0. 5mol/L 碳酸钠缓冲液（pH 9. 0 ) 调 至卩118.0，用甘油补充体积到10〇 1111。加入0人?1至终浓度为50叩/1111。充分混匀后储 存于一20°C 。固定液放置过久，颜色将变为棕色

    来源：丁香实验

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