酵母细胞的观察实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	质粒（pTD125 FY23）pDAb204 菌株（FY86 pTY20）
试剂、试剂盒	PBS BSA MgCl2 罗丹明-鬼笔环肽山梨醇血清白蛋白甲醇 KPO4
仪器、耗材	广口瓶

步骤

第 1 天提供处于对数生长期或静止期，以 4 % 甲醛固定的1-1 菌株的培养物，使用微分干涉相差显微镜（ DIC) 进行镜检，并对每种培养物里的100个细胞进行计数，记录无芽、小芽和大芽细胞的数量。提供固定了的菌株1-1 和 1-2 交配细胞的混合物。根据西蒙斯细胞（ shmoos) 和合子细胞明显不同的形态用DIC显微镜检查并鉴定它们。比较单倍体细胞1-1和二倍体细胞1-3,找出细胞大小和形态的差异。在早晨，将下列菌株置30°C过夜培养：菌株 1_1在 5m l的 Y P D 中菌株 1-3在 25m l的 Y P D 中菌株 1-3在 5m l的 Y P E G 中（除了用3 % 乙醇和3 % 甘油代替葡萄糖作为碳源外，其他成分同YPD) 菌株 1-4、 1-5 和 1-6 在 5ml 的 SC-uracil 中第 2 天线粒体稀释前一天的在Y PD 和 Y P E G 上的菌株1-3培养物到YPD 和 Y P E G 中，以便他们生长超过至少3 次倍增，密度达到IX 107〜2 X 107个 /ml (对数中期）。我们把这个技术称为“回稀释” 。用 50〜100ng/m l的 DiIC5(3)染色 5〜lOmin，在荧光显微镜下用罗丹明滤光片镜检。

芽痕如果菌体生长超过或未达到对数生长期（1X 107〜2 X 107 个/ml) , 回稀释来自前一天的菌株1-1和 1-3的 Y P D 培养物到5m l的培养液中，至少 3 次倍增。根据 “技术和方案11D，用 Calcofluor (荧光增白剂）染几丁质和芽痕” 。液泡如果菌体生长超过或未达到对数生长期（1 X 107〜2 X 107 个/ml)，回稀释前一天菌株1 -3 的 Y P D 培养物到5m l的培养液中，至少 3 次倍增。根据 “技术和方案 11C ，用 FM4-64 染色观察液泡和内室（ endocytic compartment)” 。隔蛋白（ septin) 和极化体（ polarisome),显像如果菌体生长超过或未达到对数生长期（1X 107〜2X 107个/ml) ，回稀释前一天菌株1-4， 1-5和 1-6的 SC-uracil培养物到 5m l的培养液中，至少3 次倍增。在荧光显微镜下检查G F P 荧光。肌动蛋白和微管蛋白染色早晨，回稀释前一天菌株1 -3 的 Y P D 培养物到50m l的培养液中，生长到 2 X 107 个/ m U 至少 3 次倍增。加入 34m l的 10% E M 级的甲醛 (Polysciences) 孵育 lOmin固定细胞。将固定的细胞分成等份，并按在 “技术和方案 13, 已固定细胞的肌动蛋白染色”中描述的罗丹明-鬼笔环肽染色的固定程序，和 “技术和方案12 , 酵母免疫荧光法”中描述的免疫荧光方法，免疫染色， 4°C 下过夜固定细胞。第 3 天肌动蛋白染色按照 “技术和方案13”中描述的完成罗丹明-鬼笔环肽染色程序。在荧光显微镜下用罗丹明滤片检查细胞。抗微管蛋白免疫荧光按照 “技术和方案 12 ”中描述的完成免疫荧光染色。以 1 : 500的 YO L1 /3 4 抗微管蛋白抗体和1 : 2 0 0的羊抗大鼠FIT C 二抗免疫。在荧光显微镜下用荧光滤片检查细胞。注意，由于封闭液中含有DAPI，在 DAPI通道上也可以看到核DNA的染色。

来源：丁香实验

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