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![Midi/Maxi kit) , 也可根据生产条件的不同选择NucleoBond BAC Miniprep kit 或 NucleoBond BAC Maxi kit (ClonTech) 〇 1. LB琼 脂 平 板 （12. Si^gAnL氯霉素）划菌， 37°C培养过夜。 2 . 挑取单克隆，接 种在IOOmL LB (12. SjUgAnL氯霉素）中 37°C培养过夜。 测 定 O A 。。为 1.4〜1.6。 3•转入250m L 离心瓶， 3000g•离心菌液15min。 4 . 在 IOmL RN A 酶溶液中重悬菌液，将菌团完全打散，转 入 Oak Ridge管 中 （Allegiance)。 5 . 加 入 IOmL 0. 2mol/L NaOH /1 % SDS溶 液 ，轻 柔 缓 慢 地 颠 倒 1 0 次 ，混 匀溶液，室温静置5〜lOmin，确定溶液从混浊变澄清。 6 . 加 入 8m L 冰 冷 的 3mol/L 乙 酸 钾 （ pH 5. 5)，缓 慢 地 颠 倒 1 0 次 ，混匀溶 液 （用力过猛可能污染大肠杆菌的基因组DNA) ，冰 上 放 置 15min。 7. Sorvall RC 28S 离 心 机 ， SS34 转 子 （8 管 ）或 SA-600 转 子 （12 管） ， 4°(3， 33 000^'或 更 大 转 速 （16 000]： /111丨11， 8八-600)离心30111丨11，迅速移出 上清。 ‘ 8 . 用 25m L 吸 管 小 心 的 移 出 上 清 ，避 免 吸 出 沉 淀 ，上清移入干净无菌的 Oak Ridge 管中。 9 . 按照步骤6 再次离心。即使上清液非常澄清，但为了防止柱子的堵塞最 好做此步。将上清转入50m L 管中，冰上保存。 10. 用 4mLQBT 缓冲液平衡 “Qiagen-100” 柱 。 11. 将上清上柱。 12. IOmL Q C 缓冲液洗涤Qiagen-IOO柱 2 次 。 13. 60°C下 用 5m L Q F 缓冲液洗脱DNA，将洗脱液收集到已加入5m L 异丙 醇 的 14m L 培 养 管 （VWR，目录号60818-725)中。 14. 4°C ， 11 700g 离心 30min。使用 Sorval SA-600 转 子 ， 9000r/min〜 11 700g 离心。 15. 用 5mL 7 0 % E tO H 于室温下洗涤沉淀，再 次 离 心 lOmin，小心地倒掉 上 清 ，空气 干 燥IOmin (这一步可以除去BAC D N A 中多余的盐） 。 16. 加入40(V L T E ，用切掉末端的枪头吹打重悬DNA，因 为 BACDNA很 大 ，所以需要较长的时间完全重悬DNA，也 可 以 将 管 在 室 温 下 放 置 过 夜 ，使 DNA完全溶解。随后，将 DNA转 入 I .5mL Eppendorf管中。 17. 加 入 ^OOjLtL 苯 酚 ：氯 仿 （1 : 1)，振荡混匀，在微型离心机上最大转速 离 心 5min (见 注 释 7)。 18. 将上边的水相转入干净的I .5mL Eppendorf管中。 19. 加 入 40；xL 3mol/L NaOAc和 1 1 0 0 , 冰冷的无水乙醇，一20°C放 置 2h ， 沉 淀 DNA。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470793575684sd4gxsekktpng_small.jpg)
![照 ，或者电子图像捕捉结合数字图像处理。单 色 F IS H 产生的黑白图像采用 Zeiss Axiophot 100 显 微 镜 ， Kodak Technical pan ASAlOO 黑 白 胶 片 拍 摄 。单 色 、双色或多色FISH 实验中，采 用 Zeiss Axiophot 135显微镜配备200W 汞灯， 冷 CCD照相系统捕捉彩色图像， BDS (Biological Detection System) 软件进行 处理。 2 . 多重标记探针同时与染色体片子杂交，采用单带通滤光片或多带通滤光 片依次观察。我们使用63X ， 1.2N.A. 物镜和滤光片系统来激发和观察德克萨 斯红或罗丹明、 FITC 或 Cy3、 CY5 荧光素。 CA3 和 D A 的染色体R 带型采用阿 的 平 （quinacrine) 滤光片系统观察。 3 . 检测染色体非整倍性或重排，应选择好的杂交区域中的2 0 个中期细胞进 行评估。该区域的细胞应具有高信噪比、分散比较好的中期分裂相。抓取代表性 图像，并将原始图片保存在专门的文件夹中，不应经过增强、修正或涂改。 4 . 注释 1 . 与 BAC等成熟的资源共同使用， FISH 技术成为定位人类基因和新的染 色体断裂点的最迅速准确的方法。另外，稳定的高分辨染色体带型有助于FISH 杂交确定染色体重排。根据有序列资料的BAC克 隆 ，研究者可以迅速将细胞遗 传学的结果与序列相联系，并进一步应用信息进行广泛的分子细胞遗传学分析。 2 . 我们举两个例子说明BAC资源库在分子细胞遗传学中的应用：肿瘤与生 殖有关非整倍体的检测。其他的应用包括2 1 号 染 色 体 的 分 析 癌 症 基 因 分 离 和 Williams综合征的基因组组织和构造「13]、染 色 体 非 整 倍 性 分 析 。 3 . 例 1 中 （图 2A) 将资源库中BAC克隆的探针与原发性甲状腺滤泡癌病 例的染色体进行F IS H 杂 交 ，进一步证实之 前 采 用 比 较 基 因 组 杂 交 （CGH) 发 现 的 2q2 1 的特异区域扩增， F IS H 对 于 将 C G H 观察到的低分辨的扩增与DNA 序列相联系是非常重要的。实验结果确定了一种候选基因PKCe，它可能在甲状 腺肿瘤发生中起作用[11’15]。在这项研究中BAC的应用证明：染色体区带特异性 BAC有助于识别未知的对肿瘤发生起作用的新基因，以及确定扩增区域的分子 结构。 4 . 例 2 染 色 体 非 整 倍 性 分 析 （图 2B) ， 采 用 与 染 色 体 21q22.1-22. 3 相关的 BAC探针与染色体8p23. 3 进 行 FISH 杂交，缩小与此出生缺陷有关的染色体断 裂点的范围。对比传统细胞遗传学的结果，我们发现伴随着D21S65-D21S5 5 的 缺失，存在端粒标记物D21S3 8 和 SlOOB的易位。临床结果显示唐氏综合征标记 物 D21S5 5 和 D21S6 5 的缺失，该区段到端粒的标记物二倍体。对 8p 而 言 ， 6 个 BAC确定其末稍带，只有最末端的缺失，这 说 明 8p 缺失对于孩子的出生缺陷表 型的贡献可能极小。断裂 点S T S 的确定也将候选基因与孩子缺陷性状相联系。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470793611758s76qxyq4dvpng_small.jpg)
![5 . 为了得到稳定的FISH 结 果 ，应注意下述涉及从染色体制备到图像捕捉 每一步操作的要点，最重要的步骤之一是如何得到高质量的染色体标本，其他如 DNA变性、杂交探针检测条件与之相比显得无足轻重。我们将按实验顺序说明 各个应注意的要点。 6 . 中期染色体片子的质量和标本预处理对得到好的信号至关重要。高质量 的染色体片子应满足下述标准 ：① 中期染色体均勻分散，残 留的细胞质越少越 好 ；②几乎没有染色体重叠；③染色体形状清晰可辨。为得到这样的片子，应注 意调整下述条件：低渗处理时间和细胞固定、滴片和蒸汽熏片、烤片、染色体变 性 时 间 （新鲜制备的染色体处理需要较短的变性时间） 。 适当的调整实验条件才 能得到形态清晰的染色体，不 会 出 现 “毛边”现象。这样探针才能够更有效地结 合 靶 DNA，提高结合效率。 7 . 使用多家公司的试剂盒同样都能得到高质量的BAC DNA。步 骤 17〜21 (本 章 3. 2 ) 是提取高质量的DNA必需的步骤。 D N A 中不能含有可能抑制DNA 聚合酶活性的杂质，如金属、去污剂等。通常碱 性 裂 解DNA应经过苯酚/氯仿 抽提和异丙醇沉淀的处理。 8 . 许多标记方法都适用于定位BAC克 隆 的 FISH，包括缺口平移或随机引 物法，每种都有直接和间接标记试剂。比起随机引物法，缺口平移标记的探针可 以得到较髙的信噪比，但 使 用 的 D NA 量 要 多 1 0 倍 。用 于 直 接 标 记 的 试 剂 （如 荧光素标记的核苷酸）比用于间接标记的试剂（如生物素或地高辛）昂贵得多。 当使用BAC作为探针的时候，两种标记方法能得到同样清晰的信号。我们通常 采用缺口平移试剂盒标记，使用生物素-14-dA T P 或地高辛-11-dU T P 做间接标 记 ， fluorolinkCy5-dCTP 和 fluorolinkCy3-dCTP 用做直接标记。除 DNA 酶浓 度和孵育时间外，完全按照试剂盒提供的操作步骤进行实验。标 记 后 的 D NA 片 段的大小很重要，应在1〇〇 〜5〇〇 bp，片段长度等于或大于IOOObp时 ，将产生髙 背景，弱信号，导致实验失败。 9 . 封闭和检测步骤也很重要，应注意正确的顺序和试剂。整个信号检测过 程 中 ，每一步都要很小心；片子绝不能干燥，即使只是部分的片子干燥就会影响 结果。尽管甩掉片子上的液体避免稀释抗体或下一步的试剂也很重要，但是应尽 可能的迅速进行操作。一旦片子干燥，背景将会很高、信噪比将大大降低。 抗体应小量分装后保存在一20°C 。保存超过一年的抗体使用时浓度应加倍， 如果产生高背景，可以使用Sephadex 0 5 0 柱纯化抗体，这样可以恢复正常的信 噪比；如果信号太弱，换用新的抗体。 10. 如我们之前在方法[8]中所述，采用最老的片子，几 个 月 到 几 年 （<1〇 年）同样可以得到最好的染色体带型。但是老片子不能得到明亮的F IS H 信号。 因此，为了同时得到清晰的带型和明亮的信号，新制备的片子应在50〜55°C烤 4h (烤 15h不会影响信号） 。 室 温 （20〜25°C )老化片子2〜 4 周后，将片子保存](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470793631221tdhft2hz25png_small.jpg)
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