材料与仪器
步骤
一、缺口平移
![缺口平移是一种将标记核苷酸掺入到D N A 中的方法，这 些 DNA 可以是孤 立 的 DNA片段或是一个完整克隆[39’ 4°]。该方法利用两种酶的联合作用： DNA 酶 I 在 DNA链上打开缺口形成Y端轻基， DNA聚合酶I 在 Y端羟基上加上核苷 酸 。随 着 DNA 聚合的进行， D NA 聚 合 酶 的 5'— 3'外切核酸酶活性将缺口 5'端 的核苷酸水解。反应进行过程中标记的和未标记核苷酸掺入，各 种 大 小 的 DNA 片段被合成，但 是 没 有 D N A 的净合成。产 生 的 双 链 D N A 片段在杂交前必须 变性。 1 . 制备 0. lmmol/L dTTP 溶液：将 IOOjuL 0. 3mmol/L dTTP 加入到 200PL 无核酸酶的水中。 2 . 制备 0. lmmol/L dNTP 混 合 物 ：将 0.3mmol/L dATP、 0. 3mmol/L dC TP和 0. 3mmol/L dG TP各 IOOjUL混合。多余的核苷酸混合物可在一20°C 或 一80°C保存。 3 . 对 于 每 个 标 记 反 应 ，在 放 置 在 冰 上 的 小 离 心 管 中 加 入 Iyg DNA、 0. 2mmol/L 突 光 基 团 标 记 的 dUTP 2.5/JL、 0. lmmol/L dTTP 5juL、 0. lmmol/L dN TP混 合 物 1(^L 、 10X 缺口平移缓冲液5juL，加 无 核 酸 酶 的 水 到 40斗 （见注 释1)〇 4 . 每个小离心管中加入缺口平移酶混合物IOjuiL 。 5 . 混匀并稍离心。 6 . 在 15°C条件下温育8〜16h 。 7 . 加 入 5JUL反应终止液。 8 . 为了去掉未掺入的核苷酸，加 入 乙 酸 钠 、 125juL无水乙醇， 用 12 000r/m in 的离心速度离心20〜30min。小心地倒掉上清或用微量移液器吸 去上清。加入1〇〇 1^70%乙醇，稍振荡，用 15 00(^离心51^11。小心地倒掉上 清或用微量移液器吸去上清（见 注 释 2)。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470377801115826aktrj9gpng_small.jpg)
二、随机引物标记
![随机引物标记是通过所有可能的六聚体、八聚体或九聚体核苷酸与变性的 D NA 复性进行标记的一种方法[41’ 42]。这些小的寡聚核苷酸作为引物，通 过 Klenow 酶催化掺入标记和未标记的核苷酸，使 互 补 DNA链合成。标记物是双链和 单 链 DNA 片段的混合物，因此在杂交前需变性。 1 . 制备1〇父4!^13 混 合 物 : 终浓度为1111111〇 1/1^€ 1八丁？、 1111111〇 1凡〇 1(：丁？、 lmmol/L dGTP、 0. 3mmol/L 荧光基团标记的 dUTP 和 0. 7mmol/L dTTP〇 多 余的核苷酸混合物可在一 2〇°C或一 80°C保存。 2 . 用 20juL无核酸酶的水溶解DNA (最 好 为 400〜500ng，见 注 释 5 和 6)。 3 . 加 入 20juL2.5X 随机引物缓冲溶液。 4 . 在沸腾的水中变性5min，然后快速放在冰上。 5 . 在冰上加入5JUL10X dN TP混合物、 4斗 无 核 酸 酶 的 水 ，使最终的溶液 体 积 为 49juL。 6 . 混匀并稍离心。 7 . 加 入 1/aL Klenow酶混勻，稍离心。 8 . 在 37°C条件下温育1〜6h ，较 长 的 温 育 时间通常会提高产物量（见注释 7)。 9 . 加 入 5P L 反应终止液。 10. 加 入 5&L 3mol/L 乙 酸 钠 、 1 2 5 ^ 无 水 乙 醇 ，用 15 OOOg离 心 20〜](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B14703778450833hvnsquu9npng_small.jpg)
三、DOP-PCR
![显微切割或流式分选的染色体经过PCR扩增制备整条染色体的DNA，被认 为是对某条染色体全部涂染的高质量探针的首选途径。对于单个染色体、多色 FISH (M-FISH)[43]或光谱核型分析[44]中 所 有 2 4 条染色体的涂染均是此种情 况 。下面提供的操作程序[45]是简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR) 最原始操作 程序[38]的 修 改 版 本 ，适 于 用 SpectrumOrange™ dUTP 或 SpectrumGreen™ dUTP (Vysislnc.) 扩增染色体DNA。此操作程序稍做修改或不做修改，就可 以用各种其他的标记dU TP扩增染色体DNA。反应涉及的寡核苷酸，其 5'端有 XZioI限制性内切核酸酶酶切位点， 3'端有确定的寡聚六核苷酸序列和中间有一 系列简并核苷酸序列（所有四核苷酸的随机混合） 。从理论上计算表明在整个基 因组中每4k b 就有一个这种确定的六核苷酸序列。在合适条件下，用此序列作 为引物的扩增可绕过特定的3'序 列 ，也许通过一个或更多的简并核苷to 进行退 火提髙稳定性[38]， 5'端特定序列使得该引物在较高的温度退火。在实际应用中， DOP-PCR操作程序开始的几个循环中用低退火温度（低 保 真 PCR) ，然后进行 多个循环的高退火温度（高 保真PCR)，产生随机扩增的DNA混合物。 流式分选的染色体一般通过两轮DOP-PC R 的扩增，其产物在荧光标记的三 磷酸核苷酸存在的条件下进行第三轮扩增而得到标记。虽然缺口平移方法也可以 用于标记进行染色体分析的探针，但获得高质量探针一般不需该步骤。 3. 3.1 D N A 的扩增 一般来说，流式分选的染色体进行重悬并在PCR分析缓冲液中扩增， PCR 条 件 为 ： 95°C 、 5min，然后 9 个 循 环 的 94°C 、 lm in， 30°C 、 1.5min， 72°C 、 3min，升 降 温 时 间 为 2min、 5s ; 接 下 来 进 行 3 5 个 循 环 的 94°C 、 15s ， 62°C 、 15s ， 72°C 、 15s (见 注 释 8〜1 0 ) ; 然 后 进 行 单 独 72°C 延 伸 lOmin，最后保存在 4°C 。 上 述 PCR 产 物 在 IOOyL体系中按照同一 PCR条件进行再扩增。 IOjuL](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A14703778849015c2bfb9xizpng_small.jpg)
四、用脂族胺标记DNA探针
![除了用聚合酶掺入标记核苷酸的一步探针标记法，也可以用两步标记程序， 包括：①应用上述聚合酶标记探针程序（见 本 章 3.1〜3. 3 ) 将脂族胺取代基掺 人 探 针 DNA; ② 将 修 饰 的 D NA 与胺活化荧光基团进行连接。两步标记程序使 得任何胺活化荧光基团可以与修饰的DNA进行结合，而不是只用与三磷酸核苷 结合的荧光基团商业化产品。另外，所有聚合酶标记程序可以用同样的三磷酸核 苷-烯丙胺- dU TP，因此单一的聚合酶反应条件就可以用于所有荧光标记，无需 对不同三磷酸核苷荧光基团进行反应条件最优化试验。同时，烯丙胺-dU T P 的 掺入比其他核苷酸的掺入更有效。用两步标记程序对烯丙胺-dU T P 进行标记的 试 剂 盒 现 已 有 售 （ARES标记试剂盒， Molecular Probes, Inc. ， Eugene, OR)。 应用烯丙胺-dU TP代替标记三磷酸核苷，脂族胺通过酶促反应掺入dN A ， 从而可以按照下述步骤与胺活化荧光基团、生物素或半抗原结合。该步骤同样可 以用于通过其他一些化学方法掺入的脂族胺探针的标记[22’ 46]。这包括含有通过 亚 磷 酰 胺 化 学 （核酸化学合成）掺入的脂族胺修饰的碱基，或 3'或 5'胺修饰末 端合成的DNA、 R N A 和 PN A 寡聚体。 1 . 用适当的反应缓冲液溶解胺修饰DNA，最终浓度为0.6〜I .OmL反应缓 冲液中有IOnmol脂族胺。 2 . 在适当的溶剂中溶解胺活化标记化合物，终 浓 度 为 10〜20mmol/L 。 3 . 在胺修饰的D N A 中加入多于5 0 倍 （异硫氰酸）或 100〜200倍 （羟基丁 二酯或氯磺酸）摩尔的胺活化染色剂（见 注 释 12)。 4 . 将反应溶液在室温条件下搅拌过夜。 5 . 利用水或T E 平衡和洗脱的Sephadex 0 2 5 型离心柱，用凝胶渗透层析方 法将探针和未结合的标记物进行分离。标 记 的 探 针 洗 脱 在 已 占 体 积 内 （见注释 13)。 6 . 将标记的探针在4°C或更低的温度条件下保存备用](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470377917879t4kientvrhpng_small.jpg)
五、ULS标记
![Universal Linkage System (ULS®; KREATECH Biotechnology BV，阿姆 斯特丹，荷兰）是用铂染色络合物与鸟嘌呤核苷的N7 残基反应进行标记的方法。 反应使核酸与铂荧光基团之间形成稳定的化学键。依据反应条件， U LS化合物 在较低的程度上也与腺嘌呤形成络合物。该方法已用于DNA (包括质粒，黏粒， 分子质量参考物，在低熔点琼脂糖中的DNA、 BAC、 PAC、 YAC，全染色体文 库 ， DOP-PCR产 物 ，如 卫 星 、着 丝 粒 和 端 粒 D N A 的高度重复序列） 、 RNA、 PNA、寡聚核苷酸和扩增的核酸产物[16’ 47]。在 Molecular Probes公 司 （Eugene， OR) 同样提供U LS试剂和试剂盒。 丨 用 任 何 U LS化合物进行标记的模板大小必须小于lOOObp。大 于 IOOObp的 模板通常会产生大量的点状背景。 PCR产 物 一 般 小 于 lOOObp，因此可直接进行. 标记。下 面 将 要 阐 述 的 两 种 D N A 破碎方法—超 声 破 碎 和 酶 切 均 可 以 用 于 Kreatech 和 Molecular Probes 的操作步骤 〇 Molecular Probes 用 Alexa—ULS 拭剂 时推荐用另一 DNA酶 I 操作程序。操作步骤和相应的试剂是Molecular Probes 提 供 的 U LS标记试剂盒的一部分。 3. 5. I DNA 破 碎 3. 5 . 1 . 1 超声破碎 1 . 用 T E 制 备 DNA溶 液 （20ng/ V L)，最好用至少IOOi^L DNA溶液进行超 声破碎。 2 . 将样品放在冰上，用 一 个 小 的 锥 形 底 塑 料 管 进 行 3 个 循 环 、每次循环 Im in 的超声破碎DNA。选择超声破碎仪的功率水平和工作循环数，尽量使用最 高的功率、尽量少的空泡形成。在破碎前和每个循环之后均将DNA溶液放在冰 上 Im in预冷。在第二个和第三个循环前用微型离心机的最高转速离心DNA溶 液 5s ，使全部溶液落至管底（见 注 释 14)。 3 . 取 部 分 D N A 溶 液 在 1 % 的琼脂糖凝胶上电泳确定DNA 大小是否合适。 电泳操作步骤参考本章3. 1 的步 骤 10〜14。 4 . 开始进行标记程序。 3. 5 . 1. 2 DNA 酶处理 1 . 制 备 D N A 酶 I 的储存液：用 ImL 5mmol/L 乙酸钠、 lmmol/L CaCl2、 5 0 % 甘 油 pH 5. 2 溶 解 Img D N A 酶 I (大 约 2000U/mg， Roche公 司 ， 目录号 104109)。在加冻干的D NA 酶之前和期间，缓冲液均放置在冰上。上下翻转溶 液直至完全混匀，不能振荡，储存液保存在一 2〇 °C条件下并尽量避免反复冻融。 2 . 用 IX 缺口平移缓冲液稀释DNA酶储存液，稀释比例为1 : 500 (见注释](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470377951446ctt7e9wyegpng_small.jpg)
六、间接检测的标记蛋白
![通过将荧光基团与蛋白质（如抗生物素蛋白、链霉亲和素或抗体蛋白）结合 制备间接标记FISH 探针的辅助检测试剂。许多种类的由荧光基团标记的抗生物 素 和 抗 体 已 商 品 化 （如 Accurate Chemical and Scientific Co. ， Westbury， NY; Calbiochem， San Diego, CA; Cappel Organon Teknika， Durham, NC; DAKO Corp. ， Carpinteria， CA; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA ； Kirkegaard and Perry Laboratories, West Grove, PA ; Molecular Probes， Inc. ， Eugene, OR; Pierce Chemical Co. ， Rockford， IL； Sigma Chemical Co. ， S t Louis， MO) 标记的蛋白质在实验室制备也相当容易。未标记的抗生物素和 其他抗体均可从上述所列公司获得。 作为辅助检测试剂，选择链霉亲和素多于抗生物素，因为其等电点接近中性 pH ，一般认为可以降低非特异性结合。同样，当整个抗体用于F IS H 时 ，常常 去掉较为疏水的F c 区以降低非特异结合。 F c 区可以通过木瓜蛋白酶消化从抗体 中的抗原结合簇切除，产 生 F ab 颗 粒 （单个结合臂） ，也可以通过胰蛋白酶产生 仍相连接的两个结合臂F (ab')2。 Fab'颗粒可以从F (ab')2 中制备，只是选择性 减少连接两个结合臂的二硫键。制 备 F (aV )2、 F ab 和 Fal/ 抗体片段的方法可以 从文献中找到[48’ 49]。 1 . 用 pH 8. 5〜9. 3 的 50m m ol/L硼酸稀释蛋白质至终浓度为1〜10mg/mL。 2 . 用 DMS0 、二甲基甲酰胺或丙酮溶解要求的荧光基团的N -羟琥珀酸酯衍 生 物 ，终浓度为20mmol/L 。 3 . 在蛋白质溶液中加入足够体积的荧光基团溶液，使荧光基团比蛋白质摩 尔 数 多 1〜2 0 倍 （见 注 释 1 8 和 19)。 4 . 将反应物在室温条件下轻柔摇动2h 进行反应。 5 . 利用 TBS或 PBS平衡和洗脱的SephadexG ^h型离心柱，用凝胶渗透层 析方法将蛋白质和未结合的荧光基团进行分离。标记的蛋白质洗脱在已占体积内 (见注释20)。 6 . 将标记蛋白质保存于4°0备用（见 注释21)](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/B1470377996448ar44yy3s28png_small.jpg)
七、标记探针的特征性指数
注意事项
![异性蛋白质结合反应，增加非特异性结合。 19. 蛋白质中加入的20mmol/L 荧光基团不应将有机溶剂浓度超过反应体系 体 积 的 2 0 % ，以防止蛋白质变性。 20. 作为凝胶渗透层析的替代方法，在 TBS或 P B S 中通过透析将未结合的 荧光基团从蛋白质中分离出来。每隔几个小时更换缓冲液直至缓冲液不再显示染 料颜色。 21. 在文献中有大量其他标记蛋白质的操作程序，也可从标记试剂提供商得 到 [例 如 ，见 Molecular Probes公 司 的 “胺活化探针”信息资料或Research Organics (Cleveland， OH) 公司提供的 “用荧光基团标记蛋白质操作程序”] 。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/08/A1470378105354gvtnjz7zbcpng_small.jpg)
来源：丁香实验
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