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基本方案7 体内基因传递到肺部

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	cotton rat
试剂、试剂盒	PBS 异氟烷粉末状干冰异戊烷填充材料纯化的重组腺病毒
仪器、耗材	解剖刀塑料包埋块纱布垫子锥形离心管注射器恒冷切片机异丙基乙醇海绵

步骤

1•用异氟焼麻醉一只80〜120g 的 cotton rat, 具体做法是用一块异氟烧浸透纱布垫子置于一只50m l 圆锥形管底部，在把管口放奄鼠的鼻子上。通过观察呼吸次数来判断麻醉深度，并且通过调整圆锥形管离鼠鼻子的距离来控制麻醉深度。 2. 用异丙基乙醇海绵清洁鼠的颈部，并且用锋利解剖刀切一条I c m 长的正中线切口。通过钝式解剖暴露气管，并且通过气管周围的肌肉切一个3m m 的切口。用—支^ 30G 针头的Iml注射器慢慢地将总体积为100〜150jul含 IXlO1t5 〜5X 101 。感染颗粒的 P B S 直接通过气管壁而不要开切口灌输进去，然后补灌30〇4空气。 3. 用两个U 形钉缝合切口，然后将动物关进笼内。

对小鼠而言，需要根据动物的总千克重来减少病毒的总剂量和体积。一般而言，一只 25g 重的小鼠耐受 2X 109pfu的重组病毒，通过 25〜 3 5 4 的总体积注入。在这步操作中讲到的体积将会把病毒传递到气道和肺泡区域。为了提高气管的基因转移而限制肺泡区域的基因传递，可以使用包含相同剂量病毒的更小接种物体积（ rat50jul， micel5jLtl )。 4 . 通过向腹膜内给药，用过度剂量（2〇〇 m g /k g ) 的戊巴比妥使动物安乐死。 5 . 打开胸腔暴露近身体中央端的气管。将 18G A n g i o C a t h 插到装有37 °C O C T 培养基和 P B S 混合物（I : 1 ) 的 3m l 注射器上。将 A n g i o C a t h 输液管末端插人气管近身体中央端，用三重有节缝线结扎。 6. 轻轻用力推注射器内芯直到肺部在胸腔内膨胀到可见程度（一般 2m l 〇ciyp B S )。不要使其过度膨胀。移去心脏-肺小盒放到冰预冷的P B S 中 l O m i n 。 7•从冰预冷的P B S 中拿出心脏-肺小盒，放在冰预冷的板面上，剪掉非肺组织。 8. 将肺切成大楔形物（约 l c m )，放在盛满1〇〇%〇 C T 包埋培养基的塑料包埋块，使切面贴紧包埋块底部。 9. 用粉末状干冰/异戊烷填充材料冷冻包埋块。在冷冻状态处理组织样本以使其仍然贴紧包埋块底部。 10. 用恒冷切片机切出6^m 的冰冻切片，并且进行多重组织学分析，如免疫细胞化学、组织化学和原位杂交等。支持方案 1 收获人类支气管的异种移植物做形态学分析以评价转基因表达 . 材料（标V 的条目参见附录 1) 鼠隐藏异种移植物（基本方案5 和 6) V P B S 最佳切割温度（ O C T ) 培养基（ Ba x t e r) 粉末状干冰/异戊烧填充材料解剖工具：小尖剪刀、镊子和剃刀片塑料包埋块（ Ba x t e r) 恒冷切片机 1.通过 C O 2 窒息对小鼠施无痛致死术取隐藏异种移植物，小心切下异种移植物小盒，放在一■块衬有石错膜的平坦表面。用两块刹刀片小心地将异种移植气管切成2m m 圆环通过相对的史托刀片切割边缘。去掉异种移植组织输液管接触的末端。 2•在P B S 里漂洗切出的圆环并在不含棉绒纸吸干以去掉内腔多佘的黏液。不要用镊子夹紧上皮表面。这些组织现在可以直接用来做组化染色或如下面描述的步骤一样新鲜冷冻在 O C T 包埋培养基。 3.缓慢降低异体嫁接环，将切面向下，装入到一个装满 O C T 的塑料嵌入块中。确定 O C T 能够进入异体嫁接环的腔内，否则冷冻的部分很难切

4. 用钝的钳状骨针将环推到块的底部。当放置样本时不要进人异体嫁接环的腔内。最多 6 个环可以植入到一个块中。 5. 将组织块放入粉末状的干冰中或异戊环的黏合剂中，储存在一80°C直到切片。 6•在恒冷切片机上将组织块切成6jum的冷冻切片。在免疫组化前避免新鲜的切片重复的冻融。一旦切片置于玻片上，应该将其置于恒冷切片机内（一18°C)，直到染色，避免风干。或者切片也可以在一80°C下冻存几个星期时间，不会大量丧失P-半乳糖苷酶的活性。

来源：丁香实验

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