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基本方案1 分离人气管表皮细胞

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	人肺
试剂、试剂盒	HamF-12 培养基 FBS 膜酶 EDTA 胰酶抑制缓冲液
仪器、耗材	冷冻管组织培养皿离心管桌面离心机镇铬合金或铜金属丝网平台振动器解剖器具

步骤

在冰上的组织培养罩中从人肺部切开支气管，将气管置于4°C 的培养基A 中。可以

很容易地从第5 支气管中分离出。 2. 将分离出的气管置于盛满培养基A 的150m m 组织培养皿中。从气管外部除去多余的外膜并将气管组织切成1〜2c m 的环状。将气管环横向切开暴露出气管表面。去除多余的黏液分泌物。 3. 将样本放人含有35m l 培养基A 的 50m l 离心管中（加入足够的组织使总体积达到 45ml)， 4° C 振动孵育3〇 min。重复洗6 次。如果组织在收获时已经严重感染，就需要增加润洗时间，总共为5〜6h。 4. 将样本放入一个新的离心管内，管内含有35m l 培养基A 和 0.1% (m /V ) 蛋白酶 I I V 型。 4°C 孵育36h。加人FBS，终浓度为10% (保证管中总量小于管体的75%)，轻轻振动30s。 5. 静置I m m 使得组织沉到管底。吸出培养基（含有分离的气管细胞），转入一个置于冰上的新的离心管中，将剩下的组织放入到I O O m m 的组织培养皿中。 6. 用解剖刀的顿边刮气管表面，用 4°C H a m F-12培养基/10% F B S 润洗，将洗下的细胞加入到50m l 离心管中。如果需要的话，将气管组织片保存在一8(T C 用于基因分型检测。 7. 混合所有的含有上皮细胞的上清， 4° C ，约 3OOg 离心5min。弃去培养基，用总量为 IOml的 H a m F-12培养基/10% F B S 重悬细胞。用无菌的500jum金属丝网过滤到一个 15m l 离心管中。 8•再用同样的培养基洗两遍细胞，离心收集。在最后一次离心前，移除 1〇Jum等分量的细胞悬液，用台盼蓝计数存洁细胞的释放总量（附录3 X ; —般一叶组织的释放量为 2X 107〜4X 107个细胞）。不要计入红细胞数。 9.用 IOml 37°C 培养基B 重悬最终的细胞沉淀，接种iXIO6〜2XIO6个细胞/IOOmm组织培养皿，每个皿中加人IOml培养基B 。培养24h。如果使用囊性纤维化（ CF) 细胞，在最初的24h 加倍抗体的浓度。 1〇•吸出未贴壁的细胞，用37。 (3 H a m F-12培养基洗两次贴壁细胞。用新鲜的培养基B 培养细胞，培养48h (重度污染的细胞培养72h)。两性霉素 B 对细胞是有高度毒性的，如果不是真菌或细菌污染的问题，加药时间控制在最小值。从器官移植手术室直接获取组织（较病理实验室）能降低真菌污染。 11.用培养基C 培养细胞（这一时期，上皮细胞克隆在扩增，可见）。每 3 天换新鲜的 ±替养基C 。通常情况下，细胞是为冻存、传代或移植到异种模型做准备的（基本方 $ 5)接种后 5^天（约 8 0 % 汇合度）。不要让汇合度超过8〇%，否则会开始分化。 . = 选择：移去培养基，用 5m l 0. 1 % 胰酶/E D T A 在 37°C 下孵育1〜3min，同时紧关注细胞是否脱落（附录3 I )。加入5m l胰酶抑制缓冲液。轻轻敲打平板，收 ^ 细胞。 4°C ， 300g 离心 5min，用培养基C 洗两次。用培养基c 按丨： 5 稀释传代。可参见第11步。通常，细胞可以扩增一次而不丧失在异种模型中的分化能力。 U ^ 酶/E D T A 处理细胞，轻轻敲打平板收集细胞。 4。<3, 3OOg离心5m m ，用 Iml ’ -田胞冻存液（每 1Q G m m 平板的细胞)重悬细胞沉淀。等分成im l加人到2ml

的冻存管中。在一80<€冻存过夜，在转入液氮中（附录31)。 14.用冻存细胞时，在 37° C 下快速解冻，并立即接种到37°C 的生长培养基中。没有必要移人到D M S ◦ 中

来源：丁香实验

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