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        基本方案5 直接注射重组体病毒载体至小鼠脑内

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.麻醉成年鼠,准备手术。在头盖骨上钻洞。注射的病毒可以在脑中扩散3~4 mm。

        2.4 min后用5ul 汉密尔顿注射器缓慢注射 2~4ul 重组体病毒悬液至目标区域。当注射. 元成后,将针头抬起1 mm,静置2 min,1 min内收针。

        在作者的实验室,腺病毒的滴定量是109到1011病毒颗粒/ml,腺相关病毒为1011病毒颗粒/ml,HIV或MoMuLV是109病毒颗粒/ml。

        3.如果多于两个注射点,重复第5~6步。每个鼠注射量不要大于10ul。

        4.将小鼠从脑功能区定位支架下移开,清洗头盖骨,在伤口上面盖灭菌纸巾。将皮肤盖拢,用伤口夹夹好皮肤切口,将小鼠转移至恢复笼。

        支持方案 基因修正细胞的准备

        成纤维细胞

        la.在75 cm2的培养瓶或者l0 cm的培养皿用DMEM/10%FBS培养成纤维细胞直至细胞生长至80%~90% 汇合度。不要用静止期的细胞因为这些细胞移人脑后很难成活。

        2a.洗细胞两遍,每次用10ml的PBS。加入1~2 ml的ATV胰酶到培养瓶中并在室温赙育2~3 min。拍打瓶子使细胞消化下来。

        3a.用8~9 ml的DMEM/10%FBS 重悬细胞,将其移入15 ml离心管中,1000g室温离心3 min。倒掉上清。用1ml的D-PBS重选细胞,用Iml的习惯吹打混匀。加4 ml的 DPBS 并洗细胞2次,1000g 离心3 mm。在最后一次离心之前,计数细胞。0.4 ml D-PBS重悬细胞,转移至0.5 ml的离心管中,2000 g离心1 min。

        4a.倒掉上清并用EHPBS重悬成纤维细胞,制成 50000~100000个细胞/ul的细胞悬液。置于室温或者冰上。3h 内移植细胞。

        神经祖细胞

        1b.在75 cm2的培养瓶或者 10cm 的培养皿用DMEM/F12/FGF培养神经祖细胞直至细胞生长至80%~90% 汇合度。

        2b.去除培养基,加人1~2 ml 的ATV胰酶到培养瓶中并拍打瓶子使细胞消化下来。

        3b.用8~9 ml的 DMEM/F12/FGF重悬细胞,将其移入15 ml离心管中,1000g室温离心3 min。倒掉上清。用Iml的D-PBS重选细胞,用Iml的习惯吹打混勻。加入4 ml的DPBS并洗细胞两次,1000g离心3 mm。在最后一次离心之前,血细胞计数器计数细胞30.4 ml D-PBS重悬细胞,转移至0.5 ml的离心管中,2000 g离心lmin。

        4b.倒掉上清并用含有20ng/ml FGF-2的D-PBS重悬神经祖细胞,制成50000 个细胞/ul 的细胞悬液。置于室温或者冰上。3 h内移植细胞。

        来源:丁香实验

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