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基本方案瞬时转染 293 细胞制备无腺病毒重组腺相关病毒载体

相关实验：重组腺相关病毒载体的生产实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	pXX6质粒 pSub201质粒 293组织培养细胞系 pXX2质粒
试剂、试剂盒	PBS CaCl2 饱和硫酸铵乙醇纯DMEM 2%FBS 培养基完全IMDM 10%FBS培养基完全DMEM 10%FBS培养基干冰乙醇浴硫酸铵
仪器、耗材	聚苯乙烯离心瓶超声破碎仪穿孔透析盒 —次性聚苯乙烯及聚苯乙烯离心管离心机探针高速聚丙烯离心管组织培养板细胞刮

步骤

1•用限制性内切核酸酶X k I 和讯 ndHI消化pSub201质粒（图 12. 3. 2)，切下rep 和c o p 片段，纯化长4000bp含 A A V I T R 的骨架。在位点插入目的外源基因构建r A W 质粒载体。通过双CsCl梯度分离法将irAVV载体、 pXX2 和 pXX6 质粒大量纯化（至少Img)。 2•在15c m 的皿中种2107细胞以期在第二天早上达到7 0 % 〜8 0 % 融合率。保持293个细胞线在含10% F B S 的 D M E M 完全培养基中，将皿中接近融合的细胞通过0. 05% 胰酶的E D T A 消化（见附录3 1 ) 后分装到4 或 5 个 15c m 皿中扩大培养（本实验共需 20个皿）。 3 . 扩大培养12〜16h ，将每个1 5 c m 皿中培养基弃除，加入25ml含 1 0 % F B S 的I M D M 完全培养基。孵育3h 后开始转染细胞。 4•为了转染4 个 15c m 皿，将下列物品在一次性地于50m l 聚丙乙烯管中混合： 90咫 pXX 6 辅助质粒（腺病毒辅助基因）； 30jug r A A V 细菌质粒； 30/xg pXX 2 辅助质粒（ A A V 辅助基因）； 0. 4ml 2. 5mol/L C a Q 2 溶液；

加去离子水至4ml。总 D N A 量约为37. 5哗/板，且 A A V 辅助质粒、 A d 辅助质粒和rA A V 细菌质粒的摩尔比约为I : 1 : 1。 5.加 4ml 2X HeBS溶液于第4 步所得混合物，用 IOmI 塑料移液管吹吸3 次混勻。室温孵育 1〜5min。在 40X 显微镜下可见明显沉淀（如果沉淀过粗，减少孵育时间）。 6•将含D N A / CaCl2 沉淀的悬液摇5s 混匀，然后向4 个 15c m 平皿中的细胞分别逐滴加入2m l 第 3 步所配培养基。摇平皿使溶液分散开。 7. 重复第4〜6 步每次转染4 个皿，直至 20个皿转染完毕。孵育细胞24h。 8. 孵育24h 后，吸出培养基（为防止细胞脱水，一次操作两个平皿），然后加预热至 37°C 的含2 % F B S 的 D M E M 25ml。孵育细胞直至48h 后转染完毕。‘ 9. 用细胞刮从组织培养平皿中把细胞刮下，收获细胞和培养基从而收获细胞和上清液，将悬液转至250m l 聚丙烯离心管中。 1〇•将悬液放入干冰/乙醇浴中和37°C 水浴箱中反复冻融（除去病毒质粒）3 次（悬液可在一20°C 下保存6 个月）。 11. 4°C ， 3000g 离心IOmin沉淀细胞。倒上清至另一新的250m l 聚丙烯离心管。分开保存上清液和细胞沉淀。 12. 为了沉淀上清液中的病毒，每 250m l 上清液中加入（ NH4)2SO4 78. 25g，充分混勻硫酸铵，然后继续冰上沉淀20min。 4°C ， 8300^•离心lOmin。 13. 轻轻将上清液倒人另一容器，将其与离心管壁上和底部的浅黄色沉淀分离开。高压灭菌处理上清液（勿用漂白剂）后弃之。将含有沉淀的离心管继续放在冰上沉淀，直到第11步的沉淀处理好。 14•往第11步所制的沉淀中加人20ml OPTI-MEM I 培养基，用吸管上下吹打或旋勻使沉淀溶解。转至一次性50m l 聚丙烯离心管。 15.戴上声保护装置，室温下在病毒组织培养盖中声处理细胞沉淀（40burstS， 5 0 % 的功率，力度2 ) 。见沉淀变成混浊细胞溶液。 16•室温3000g 离心5min，用于沉淀不溶解的碎片。收集澄清上清液并转至一个一次性的50m l 聚丙烯离心管中。 17•用20ml O P T I - M E M I 培养基重新溶解沉淀，重复第14〜16步。 18. 混合第16〜17步所得上清液。用吸管将这些混合后的上清液吹打离心管（第 13步所得）壁及底部使得硫酸铵沉淀溶解。 19. 量得第18步所得液体体积，将饱和硫酸铵与p H 7. O 的含病毒的悬液按1 :3 的比例混合。混勾后，置于冰上l〇 min。 20. 4°C ， 7700g 离心IOmin (可见管底有黄色沉淀）。将每种上清液转至50m l 高速聚丙燦离心管。 21. 根据第18步所得溶解产物体积，将 4°C 饱和硫酸铵溶液和溶解产物按2 : 3 的比例混合，将此样本置于冰上20min。 22. 4°C ， 17 OOOg离心20min，此时有大量沉淀形成。将沉淀移出，弃上清前高压灭菌 (勿用漂白剂）。 23. 用20ml (共20〜40个平皿）1 . 3 7 % 的 CsCl溶解沉淀，当沉淀尽可能完全溶解时，

混合后，才看不见不溶物。 24.往 2 个 12. 5m l 的超净管中分别加入0. 5ml I .5g / m l 的 CsCl溶液。将管倾斜，再分别缓慢加入约12m l 病毒标本覆盖I.5g / m l 的 CsCl溶液。随着标本的配制将管子沿着边缘竖立起来。 25.15°0,288 00(^离心标本36~4811。以50(^/111丨11的速度减速，而后关闭刹车阀。在管的中央可见一可能存在的弥散性的A W 环。 26•用7 0 % 的乙醇擦拭离心管的外部，在管底部呈90°角插入一 21G 针 Icm使得这—角度可以导人无菌微管。每管 10滴，收集15〜20份。 27. 用一 r A W 特有探针通过打点从每份样本中取1〜5^1来测定找出高峰（见支持方案 1)。 r A W 峰值在 1. 40〜I.42g/ml 梯度，可以用折光计验证（用后需将折光计擦干净）。 28. 可选做：加 1.37g/ml C sC l溶液至每份中使得终体积为12ml。加〇.5m l浓度为 1.5g/m LCsQ溶液至一超净管中，将病毒溶液置于其上如第2 4 步，重新离心，导入管子，测定梯度同第25〜27 步。 29. 4°C，用 MWC〇 10 000 Slide-A-Lyzer 透析盒加入 3 次 500ml 无菌 I X PBS 透析 rAVV，至少 3h (或过夜)。 3〇.将病毒溶液等量分装（一般 100〜200jul) 以避免反复冻融。菌液可在一2(T C 或一80°C 保存至少一年。备选方案用肝素纯化柱纯化 r A W 附加材料（基本方案；标V 的条目参见附录1) VPBS-MK n/ 1 5 % 、 2 5 % 、 4 0 % 和 6 0 % 碘克沙醇 P B S - M K 包含 lmol/L NaCl 0. 5mol/L NaCl 2 0 % (V /V ) 乙醇酸红（Life Technologies) 乙醇 Econopump 螺动泵（ Bio-Rad 公司） 32. 4m l 密封玻璃管（ Beckman公司） 50|ul桂酸硼毛细玻璃移液管（ Fisher公司） Beckman超级离心管和70T i 转头（或等效物） Iml 或 5ml HiTrap 肝素柱（Amersham Biosciences 公司） F P L C 仪 Slide-A-Lyzer 穿孔透析盒（M W C O 10 000) 工.开始转染，从 r A W 中去除硫酸铵沉淀（基本方案，第 1〜2 2 步），用 PBS-M K 溶解硫酸铵沉淀，加至 15m l刻度线。

2. 启动Econopump，将一次性硅酸硼毛细玻璃管插人管中。按照说明书校对泵。将溶有磷酸盐沉淀P B S - M K (第1 步所得）等量分装于两个密封玻璃管中。 3. 每个管中插入一毛细玻璃管，以 3ml/m i n 的速度抽吸，用 6ml 1 5 % 碘克沙醇和 lmol/L NaCl无气泡地将菌液覆盖。 4•用第3 步的技术，先后加入5m l 的 2 5 % 碘克沙醇和5ml 4 0 % 的碘克沙醇（迅速包含病毒）覆盖菌液。 5. 加入5ml 6 0 % 的碘克沙醇覆盖后设置了梯度，小心移动毛细玻璃管而不打乱梯度。缓慢往病毒溶液中加人P B S 形成管的最上层直到管被装满。 6 . 每管盖上塞子， 15°C〜25°C， 500 OOOg• 离心 lh。 7. 小心移动管子，在病毒罩中，打开密封塞，插入一与5m i 注射器相匹配的18G 针头至 6 0 % 碘克沙醇那部分之上，抽出4 0 % 碘克沙醇溶液（明显分层），留下的〇.5ml，所以2 5 % 碘克沙醇溶液带不会被抽出来（图 12. 3. 3)。有需要的话4°C 保存病毒过夜8 . 用缓冲液A (PBS-M K ) 泵洗，然后在F P L C 中插人一肝素柱。来自 2 0 个 15c m 平 m 的一种病毒可用一个 I m l 的肝素柱纯化，更大量则需 — 5m l 肝素柱。 9 . 用 5 倍柱体积的缓冲液A (PBS-M K ) 平衡柱。为了注射标本，将抽吸速度减为iml 柱 0_2ml/min或 5m l 柱 lml/min，然后注射标本。收集过柱的部分（洗漆，流过，洗脱)。 10. 用 5 倍柱体积的缓冲液A (PB^ M K ) 洗柱。 11. 用 5 倍柱体积的缓冲液B (含lmol/L N a C l 的PBS-M K ) 按线性梯度从0% 〜]_〇〇 %

洗脱联合病毒，收集其中的〇.5ml (Iml柱）或 Iml ( 5 m l 柱) 。比用两倍柱体积的缓冲液 B ( 含 lmol/L N a C l 的 F B & M K ) 洗柱。取出肝素柱弃之。 13. F P L C 分析病毒前用〇.5mol/L 的 N a O H 顺着内管流过灭菌。用 2 0 % 的乙醇装满内管保存。均用新的肝素柱纯化病毒避免准备好的病毒之间的交叉污染。，为了找出病毒的高峰值（支持方案 1 ) ，用一 A V V 专用针通过打点的方法测定整个病毒纯化物的各部分。 15.将含有最高rAAV滴定量的部分倒出，用 MWCa 10 000 Slide-A-Lyzer透析盒将两个 IL 变化的PBS 4° C透析2h。工6.将病毒悬液分成1〇〇〜 200/x l的等份。一 20°C或一80°C下保存（可保存一年以上）。支持方案1 用打点分析法测定r A V V 的滴定量在这一部分有一明显标志表明 r A W 病毒体制备成功，且定量得出每毫升有一定量的病毒体。材料（标V 的条目参见附录1) 病毒部分或终病毒的准备（基本方案或备选方案） V D N a s e 消化缓冲液 V 0. lmol/L E D T A V 蛋白水解酶溶液 0. 5mol/L N a O H 用于重组病毒的 r A A V 质粒（基本方案，第 1 步） V T E buffer , pH7. 5 0 •5mol/L N a O H 包含 lmol/L NaCl V 0. 4mol/L Tris • Cl pH7. 5 0. 5mol/L NaCl 包含 0. 5mol/L Tris • C l ， pH7. 5 转基因用放射性标记探针（根据生产商的说明书，用 Boehringer M a n n h e i m 随即引物 D N A 标记试剂盒进行操作） 9 6 孔板 50°C 水浴箱圆点印记仪 0. 45jum 尼龙膜（ Zeta-Probe， Bio-Red) 1• 设计一个于 9 6 孔板成对地对样品、控制样、标准 D N A 定位的实验方案。 2 . 将样品（通常加5JLJCSC1，如果这种病毒有C s C l则取柱子纯化的20一混合物）和控制样于9 6 孔板的适当位置，在每个孔中加D N a s e 消化液6〇 4 并 37°C孵育 lh。 3 . 每孔加 IOfJ 〇. l m d / L 的 E D T A 停止消化，混匀。加 60M1 蛋白酶溶液使病毒体 D N A 释放， 50°C 孵育半小时。 4 . 每孔加 120^10. 5mol/LNaOH 使病毒 DNA变性，并在室温下孵育 l 〇 min。 5 . 准备线性化的质粒（用于这种病毒转染的质粒） O.ljug/Vl用于制备 D N A 标准浓缩物。用 IOOjLzl、 pH7. 5 的 T E 缓冲液制备稀释 5 倍的溶液，通过加 12. 5|ul D N A 到

112. 5^1 T E 缓冲液（在第 1 步）紧接着混合25“ 从一个孔到邻近的孔（分别为 625ng、 125ng、 50ng、 ln g 、 200pg、 40pg) 。 6 . 力口 IOOjLtl 0 •5mol/L N a O H /lmol/L NaCl 到每个孔来变性 D N A 标准物 D 7 . 用 p H 7.5 的0.4m d / L Tris . Cl平衡尼龙膜，准备提前润湿的尼龙膜的圆点印记复合仪。 8. 加没有经过真空处理的变性D N A ，接着做真空处理。 9. 打开仪器，取出尼龙膜，于 100ml p H 7. 5 的〇.5mol/L NaCl/0. 5mol/L Tris • Cl 中轻轻振荡清洗5min。 10. 用放射物标记特异的r A A V 序列探针（如 A P P E N D I X 3G ) 检测冲洗的滤膜。探针应该被限定在基因转化暗盒里并且不包括质粒的主链片段或I T R 序列。 11. 将滤膜对准胶片曝光（放射性自显影）。显影结束后，对准部位，删除滤膜部分，用闪烁计数器进行定量分析。计算多少标准质粒分子复合给定的r A A V 稀释液。切记质粒是双链D N A ，而 r A A V 病毒只包含单链D N A 。支持方案2 细胞体外感染r A A V 和用转基因表达进行效价研究转导的效价随细胞类型的不同而有所差别，但对于标准的细胞株来说，转导效价可通过相同转基因r A A V 的比较来得出。这种效价能通过确定特定细胞的特定转基因的效率的颗粒的数目来比较。当永生细胞株被培养和在体内转导相比较时效价也会不同。注意：为了评价转导效价，将细胞同时用腺病毒转导（见单元12.2)，这种方法起到了协助病毒和提高转导效率的作用。添加腺病毒能够诱导更适合A A V 感染的环境，这样能更好地指示有转导能力的颗粒的数量。但是，由于腺病毒有抗原性并且不能在体内使用，所以它会有细胞病理效应。因此，用腺病毒在体外推导出的效价不能精确地反映体内的转导能力。这需要每位研究者分别对不同的r A A V 试剂建立一套标准的滴定程序。材料靶细胞靶细胞培养基（见补充的细胞说明书）有适当的转基因的r A A V (见基本方案或备选方案）组织培养板（为分析转导的效价，推荐使用多壁板） 1. 在有合适的培养基的多壁组织培养板上种上适当的靶细胞。合适的靶细胞类型，数目和密度有表达分析来决定。细胞在感染前不能用〇;^八合成抑制剂（如阿糖胞苦）处理。 A A V 是一种单链病毒，并且基因能够表达时需要合成双链。 2. 直接在细胞培养基中加rA A V 或在加入细胞前将r A A V 与新鲜培养基迅速混合。为分析转导效价，将 r A A V 原液用血清稀释5 倍后感染细胞。也可以在种板的时候感染细胞。孵育时间依分析方法而定。合适的r A A V 的数量由转移基因、细胞和分析方法决定。当感染复数为5 时（见上注解）， 5 型腺病毒可以随意的与r A A V —起加入。

来源：丁香实验

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