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        培养细胞系中基因表达的评估

        相关实验:α-病毒:作为基因 转移载体的西门里克森林病毒和辛德毕斯病毒

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        培养细胞系中基因表达的评估

        材料

        试剂

        冰乙酸

        Amplify (Amersham)

        抗体

        一 抗(针对目的抗原)

        二 抗(针对一抗)

        目 的 细 胞 系 .• B H K - 2 1、 C H O K l 、 H E K 293

        C h a s e 培养基:添 加 2 m m o l/ L 谷氨酰胺、 20 m m ol/L H E P E S 和 15ug/m l 未标记蛋氨酸的 M E M 培养基

        E C L 化学发光试剂盒(A m e r s h a m )

        裂解缓冲液

        50m m ol/L T ris-H C l (p H 7. 6)

        15 0 m m o l/L N aC l

        2m m o l/L E D T A

        1% (V fV s) N onidet P-40 (Sigm a-A ld rich )

        甲醇

        [ 35S ] 蛋 氨 酸

        牛奶

        磷 酸 盐 缓 冲 液(P B S )

        聚 丙 烯 酰 胺

        SD S

        饥 饿 培 养 基 :添 加 2m m o l / L 谷 氣 醜 胺 和 20m m o l / L H E P E S 的 无 蛋 氨 酸 的 M E M

        培 养 基

        T r i s 盐 缓 冲 液(T B S )

        Tw een-20

        病 毒 储 存 液

        根据方案 1 制备的表达目的基因的重组α病毒。

        仪 器

        细胞培养板(6 孔、 12 孔 和 24 孔)

        H y b o n d E C L 尼龙膜滤器(A m e r s h a m )

        Hyperfilm-MP

        放射性强度探测器

        S D S —— P A G E 设备

        蛋白质印迹设备

        方法
        1.用梯度稀释的病毒储存液在 6 孔、 1 2 孔 或 2 4 孔板上感 染 相 应 的 细 胞(B H K -21、C H O K l 、 H E K 293)。

        2.分析基因表达。

        蛋白质印迹

        a. 在感染后不同的时间点,每 个 6 孔 板 孔 中 加 入 250^x1 裂解缓冲液,冰上放置 l Omin。

        b. 重悬细胞。

        c. 上样样品,然后在正常标准下 1 0 % 〜12% S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳。

        d. 将蛋白质转到尼龙膜上。

        e. 4°C 下,将尼龙膜放在含 5% 牛奶和〇.1 % T w e e n -20 的 T B S 中孵育 30m i n 。

        f. 室温下将尼龙膜放在一抗中孵育 30m i n 。

        g. 室温下将尼龙膜放在二抗中孵育 30m i n 。

        h. 根据厂商说明,用 E C L 化学发光试剂盒显示特异的蛋白质带。

        代谢标记

        a. 弃去细胞的培养基并用 P B S 洗潘一次。 _

        b. 加人饥饿培养基, 37°C 孵 育 30m i n

        C . 用 含 5 0 〜lOOuCi/m l 的 [35S] 蛋氨酸的饥饿培养基替代饥饿培养基。

        d. 37°C 孵育 20m in。

        e. 弃去培养基并用 P B S 洗涤一次。

        f•加人 chase 培养基,孵 育 15 min〜3 h 。

        g. 弃 去 chase 培养基,用 P B S 洗涤一次。

        h•每个 6 孔板的孔中加人 250ul 裂解缓冲液,冰上放置 lOmin。

        i- 重悬细胞。

        j•上样样品,然后在正常标准下 1 0 % 〜1 2% S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳。

        k •室温下用 1 0 % 冰乙酸/ 3 0 % 甲醇固定凝胶 30m i n 。

        1•用 A m p lify 替换固定溶液。室温下孵育 30m i n 。

        m . 将凝胶晾干,进行放射活性鉴定并将凝胶放在 H y p e r f i l m - M P 中 2〜24 h 。

        n•做 X 光片并观察放射性带。

        原代细胞的感染
        原代细胞,尤其是原代神经元,对物理和化学物质很敏感。应防止对这些细胞的多余操作,来自培养 B H K 细胞的培养基对神经元细胞有毒,建议使用对病毒储存液的纯化和浓缩步骤。

        a•从 E 17 期胚胎中分离原代大鼠海马区神经元。

        b•用添加了 1 0 % 马血清的 D M E M 培养基培养细胞。

        c•往原代细胞中直接加入合适的病毒浓缩液。

        d. 防止对细胞的多余操作。

        e. 做时间点测试,以确定最佳的表达条件。

        来源:丁香实验

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