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        病毒滴度的确定

        相关实验:α-病毒:作为基因 转移载体的西门里克森林病毒和辛德毕斯病毒

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        病毒滴度的确定

        材料

        试剂

        抗体

        一 抗(抗靶抗原的特异抗体)

        荧光素偶联的二抗(一抗特异性的)

        B H K - 2 1 细胞

        根据研究,可以使用其他类型的细胞。

        封闭缓冲液:含有〇.5 % 明胶海绵和 0•2 5 % 牛血清白蛋白的 P B S

        完全培养基

        针对使用的细胞类型选择。

        D A B C O

        甲醇

        M g C l 2 (l m o l /L )

        室温保存。

        Moviol 4-88

        磷 酸 盐 缓 冲 液(P B S )

        铁 氰 化 钾(50m m o l /L )

        4°C 保 存 。

        亚 铁 氰 化 钾(50m m o l /L )

        4°C 保 存 。

        溶 于 DMF 或 DMSO 的 X-gal ( 2 % )

        —2 〇°C 保 存 。

        病毒储存液

        按 照 方 案 1 制备的可表达 G F P 、β半乳糖苷酶或其他目的抗原的重组 a 病毒。

        仪器

        细胞培养板(6 孔 或 12 孔)

        盖玻片

        荧光显微镜

        玻片

        方法

        基因表达的显示

        1.将目的细胞系接种至 6 孔 或 12 孔细胞板上或盖玻片上。将细胞培养至一定的浓度。

        2•用梯度稀释的可表达报道基因或目的抗原的病毒储存液感染细胞。

        3.37°C 培养细胞过夜。

        4 . 转染后 4 8 h 内确定滴度。

        在早期的时间点,信号可能未达到最佳,一些突变的载体尤其是这样。在后期的时间点,细胞病变效应逐渐使细胞脱落。

        通过检测 G F P 确定滴度

        a. 用荧光显微镜检查细胞培养孔或盖玻片。

        X-gal 染色确定滴度

        a. 制备新鲜的 X -gal 染色溶液,将各种储存液稀释到 P B S 中至终浓度含 5m m o l / L铁氰化钾、 5m m o l / L 亚铁氰化钾、 2m m o l / L M g C l 2 和 l m g / m l X -gal。

        b . 用 P B S 洗涤细胞。

        c•用冷甲醇一 20°C 固定细胞 5m i n 。

        d. 用 P B S 洗涤细胞三次。

        e’. 室温或 37°C 用 X -gal 染色溶液染色细胞至少 2 h 。

        f. 计 数 X -g a l 阳性细胞。

        通过免疫荧光确定滴度

        a•用 P B S 洗涤盖玻片两次。

        b•用冷甲醇一 20°C 固定细胞 6 min。

        c. 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。

        d•室温下用封闭缓冲液孵育 30 min 以封闭非特异性的结 合 。

        e•用一抗代替封闭缓冲液,室温下孵育 30 min。

        f . 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。二抗室温孵育 30 min。

        g•用 PBS 洗涤盖玻片 3 次,用水洗漆一次,空气中晾干盖玻片。

        h. 将盖玻片在玻片上用 IOmI 含 2. 5 % DABCO 的 Moviol 4-88 封片

        i . 用荧光显微镜观察。计数阳性细胞。

        5•将阳性细胞数与稀释倍数相乘,将滴度表示为感染颗粒数/m l。

        来源:丁香实验

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