基本方案2 DM 患者gDNA三核苷酸重复的杂交分析

最新修订时间：2024-05-13

原理

gDNA杂交分析对于确定DM>250bp 的扩增特别有效。此法可用于排除 E3 至 E4 类扩增（表 9.4.1)，后者通过 CTG-PCR 只有一条等位基因可见，并且 CTG-PCR 产物与（CTG)₁₀ 杂交不能检测到原突变或扩增（基本方案 1)。
基本方案2 DM 患者gDNA三核苷酸重复的杂交分析

材料与仪器

实验材料	纯化的gDNA
试剂、试剂盒	10 X 限制性内切核酸酶缓冲液溴化乙锭分子质量标记物中性化溶液预杂交杂交缓冲液 NaOH 10 X 凝胶载样缓冲液琼脂糖胶 1 X TBE 缓冲液洗脱缓冲液 EcoR I 限制性内切核酸酶
仪器、耗材	厚梳齿铸造托盘带正电尼龙膜滤纸

步骤

1. 以 50U (如为D N A 自动抽提仪提取的D N A ，贝 Ij 可能需更多酶量并加4mm〇1/L亚精胺）£ C0R I 消化纯化的g D N A (每泳道2〜5吨)。 2. 消化D N A 时，用不含漠化乙键的I X T B E 缓冲液配制〇.6%琼脂糖凝胶，将凝胶倒人插好I.5m m 厚梳齿的20c m X 20c m 铸造托盘中。 3•消化好的D N A 中加入IO X 凝胶载样缓冲液（终浓度为l x ) 卜样革凝將宜由— 个点样孔应为合适的分子质量大小标记物。 ' 4•在不含漠化乙键的I X T B E 缓冲液中以35V 、 40m A 将凝胶电泳2〇〜22h，然后升至最大45V 、 50m A 继续电泳5〜8h 直到二甲苯胺染料前端到达凝胶的底部。 5. 在 500m丨含l.C^g/m卜溴化乙锭的I X T B E 缓冲液中染胶2〇〜3〇 min给染好的拍照。 ^ 6. 凝胶在500ml 0.4mol/L Na O H 溶液中变性30min (对于其他种类的膜用甘他方安）

7. 在>500m l 0.4mol/L N a〇 H 溶液通过毛细管转移D N A 至带正电的尼龙膜。转移6h 至过夜。 8. 转移后，从凝胶上取下尼龙膜，置中性化溶液中轻柔振荡，孵育 15min。 9. 将膜轻放至滤纸上吸干。通过80°C 烘烤15min或交叉连接固定D N A 。 10. 在预杂交/杂交缓冲液中， 65°C 预杂交膜> lh。 11. 在预杂交/杂交缓冲液中， 65°C下，与 IO6C p m 柱纯化的 [«-32P] dCTP-pGB2.2杂交过夜。 12. 杂交完成后，按照下述严格洗脱杂交膜：洗脱缓冲液洗脱两次，每次l〇 min，室温；洗脱缓冲液V —洗脱2 或 3 次，每次lOmin， 65〜70°C 。 13. 用滤纸将膜吸干，以塑料薄膜包裹。 14. 一80°C ，将杂交膜与带增光屏的X -A R 自显影胶片曝光过夜。

来源：丁香实验

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