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基本方案1 脆性 X 重复片段的 PCR 扩增

相关实验：脆性 X 综合征的分子分析实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

试剂、试剂盒	0.67 X 和 2. 8X TBE 缓冲液 dNTP 混合物 DMSO (Sigma)10 X PCR 扩增缓冲液 Taq 酶快速轻便杂交试剂 pH7. 5 TE 缓冲液 2 X SSC 载样液
仪器、耗材	真空炉水浴锅电转染设备快速轻便基因组作图探针试剂盒正电荷尼龙膜无粉手套循环热反应仪垂直凝胶电泳设备

步骤

1•按以下组分在1.5m l 微量离心管中准备每次P C R 反应混合物（为保证足量， < 2 0 个样品准备n+ 1 份，> 2 0 个样品则准备n+ 2 份）： IfjJ I O X P C R 扩增缓冲液（终浓度为I X ); 0. 3jul25mmol/L MgCl2 (终浓度为 0. 75mmol/L ); 0• 如1 10mmol/L dNTP 混合物（各 dNTP 终浓度为 2 ( % mol/L ); 5|ul lOjumol/L 的引物 1 (终浓度为〇.5jumol/L ); 5jul lOpmol/L 的引物 3 (终浓度为 0. Spmol/L ); IjlJ D M S O (终浓度为 10 % ) ; 0. 05pl 5U/ml Tag D N A 聚合酶（〇.25U ); 4. 85^ H 20 。 2.取 9jul上述P C R 反应混合液至标记好的〇.2m l 微量离心管管底。 3•稀释样品D N A 至 3〇〜lOOng/y ，振荡，每个 P C R 反应加 1^1 D N A (50〜IOOng D N A 可有较好扩增）。 4 . 将样品置入P C R 反应仪中，按以下条件进行扩增起始步骤： 4min 94°C (加热) 3 0 个循环: Imin 94°C (变性) Imin 63°C (退火) 2min 72°C (延伸) 5. 在一小型垂直电泳设备上（如 B R L V 15.17;附录3F) 准备含8.3mol/L 尿素的6 % 的变性聚丙烯酰胺凝胶。或者准备使用SequaGel-6。在 0. 6 7 X T B E 缓冲液中，以约

500V 恒定电压预电泳30min左右。 6.每个P C R 产物取2〜4jul与 2 倍体积的载样缓冲液混合，并振荡混匀。置样品于 100°C水浴lmin，然后置于冰上（或 4°C)。上样，其中包括两孔〇.4nCi32P 标记的 D N A 分子质量标记。 7•在0.67X T B E 缓冲液中，以 500V 恒定电压电泳90min左右。电泳完成后，将胶修整至12c m X 16c m 大小，以适应预先切好的膜片。 8. 戴无粉手套，在凝胶上覆盖一张塑料薄膜。以铲板抬起凝胶一侧，使其与塑料薄膜黏附，然后将凝胶转移至薄膜上。塑料薄膜一侧朝下，凝胶一侧朝上，将凝胶展平放好。将带正电、预先切好（ 12cmX 1 6 c m ) 的尼龙膜盖在凝胶上，避免产生气泡。以 2. 8X T B E 湿润三张滤纸，放置在胶上。 9. 把电转仪的下面部分置于纸上，翻转，使凝胶面朝上。将凝胶上的塑料薄膜移除。在胶上放置三张2. 8X T B E 湿润的滤纸以完成整个三明治夹心。小心转动移液枪枪头除去三明治结构中的任何气泡（重要）。放置电转设备的上部于三明治结构上。根据生产厂商要求，以 3m A /cm2恒定电流电转30min。 10. 将尼龙膜与三明治结构分离， D N A 面朝上，放置于0.4mol/L N a O H 湿润的Whatm a n 3M M 滤纸上，静置约lOmin。 11. IOOml 2X S S C 溶液洗膜5min。以 Whatman 3M M 滤纸吸干，将膜置于80° C 真空炉 15min。 12. 探针杂交参照Quick-Lite Hybridization及 Genome Mapping试剂盒（或者参照单元 9. 4 的基本方案1 ) 如下。 a•开始前将所有洗脱溶液预温至55°C 。 b.35ml 55°C 洗脱液I 中将膜预湿5min。 c. 除去洗脱液I ，加人 30m l 杂交液及4 4 以碱性磷酸酶标记的（ C G C )n 探针。 55°C 杂交 20min。 d. 50m l 洗脱液I 55°C 洗脱20min。倒去溶液。 e.50ml 洗脱液 n 55°C 洗脱 20min。 f. 室温下，以 50ml IX Quick-Light缓冲液清洗两遍，共 5min。 g. 将膜置于塑料袋中，一侧封口。以 Lumi-Phos喷 6〜8 次。 13. 将塑料袋中气泡除去，封口，清除塑料袋外侧多余的Lumi-Phos。 37°C 曝光X 线片适当的时间（根据探针使用的量）

来源：丁香实验

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