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乳动物分裂中期染色体姐妹染色单体耳换的分析

相关实验：姐妹染色单体互换（SCE) 分析

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	无菌肝素抗凝血
试剂、试剂盒	固定液 Gurr 缓冲液秋水仙胺 Hoechst33258 原液吉姆萨染液 BrdU 低渗液
仪器、耗材	组织培养瓶含促细胞分裂剂的培养基白炽灯染缸锥底玻璃或聚丙烯塑料离心管封固剂盖玻片水浴箱标准台式离心机黑色塑料镜片盒解剖刀片聚丙烯塑料吸管清洁的显微镜玻片乳胶黏合剂

步骤

1. 将 0. 3m l 无菌肝素抗凝全血加入含有i〇 m l含促细胞分裂剂培养基的25cm2 组织培养瓶中。培养24h。 2. 于培养瓶中加入50jul新鲜解冻无菌2mmol/L 的 Br d U 溶液使其终浓度为10jumol/L (3pg/ml)。继续培养 48h。细胞必须在含B r d U 的培养基中完成2 轮 D A N 复制以获得预期的染色图，所以通过观察研究对不同类型细胞的细胞周期做出大致的估算是必要的。大部分哺乳动物细胞在培养过程中细胞周期为24h ; 采用这个时间一般是可以获得成功的。 3 . 于培养瓶中加入 150jl J 10jng/ml的秋水仙胺（终浓度 0. 15jitg/ml)，孵育 30min。 4. 将培养产物转入15m l 维底塑料离心管，室温下180g 离心 lOmin。移去上清，留约 0.2ml，轻轻敲击离心管使细胞沉淀重悬。贴壁培养的细胞须用胰酶消化下来后才能从培养瓶中转出。 5. 缓慢加入6m l 37° C 低渗液，同时轻轻振动离心管。 37°C 水浴箱中水浴l2min。 6. 于细胞悬液中加人4 滴新鲜配制的固定液，同时轻轻敲击离心管。倒转离心管一次使其完全混勻。室温下180g•离心l. Omin。 7. 移去上清，留约0.2ml，轻轻敲击离心管使细胞沉淀重悬。加入5m 〖固定剂，开始一滴一滴地加入，然后快速加入，振动离心管使细胞一直保持悬浮状态。 4。〇下放置 20mino 8.室温下180g 离心lOmin。移去上清，再加人5m l 固定剂，轻轻混匀，室温下离心lOmin。重复该步骤2 或 3 次，直到细胞沉淀变为无色。 9. 移去上清，余少量固定液重悬细胞，使细胞成为稍混浊的细胞悬液。 10. 甩去显微镜玻片上多余水分。用塑料移液吸管吸取少许细胞悬液。吸管吸头应保持在玻片上方2. 5c m 的高度，每张玻片上滴3 滴细胞悬液，每一滴都应滴在玻片表面的不同部位以使每滴细胞悬液都可以在玻片上充分展开。稍微倾斜玻片使其干燥。 11. 相差显微镜下观察，评价分裂相的质量和数量（如放大16倍观察）。室温下闭光放置玻片2〜3d 使玻片老化（如放入黑色塑料镜片盒中）。降低存放玻片的水温可减少染色体的过度分散。为得到分散良好的分裂相，如有必要可调聲固定液的体积。过浓的细胞悬液使细胞丛集于玻片上，会干扰不同的染色。玻片准备的更多细节详见单元4.1

制备 4 张玻片以备不同的染色条件。剩余的细胞悬液可于 5〜 I O m l 固定液中一 20°C保存。今后如再需制备涂片，则将细胞悬液取出置于室温，离心后更换新的固定液。 12. 在 9ml水中加入Iml 250^g/m l的 Hoechst33258原液（4°C保存 1 〇〜12d)。在染缸中加入49ml水和 Iml稀释后的Hoechst33258溶液，染料终浓度为〇. 5^g/ml。 13. 将几张老化玻片放人含有Hoechst33258稀释液的染缸中，室温下放置 I2min。清水反复冲洗玻片。 14. 在每张湿的玻片上放置一张2 4 m m X 5 0 m m 盖玻片，用乳胶黏合剂密封盖玻片边缘。玻片置于6 0 W 白识灯下方38cm (15in)处过夜。 15. 揭去乳胶黏合剂，用解剖刀片掀起盖玻片（而不是玻片）的一角将其翻转。将玻片交错置于已60°C预热 2 h 的盛有水的染缸中，玻片间应留有空隙，放置10〜12min。 16•在一染缸中加人49ml Gurr缓冲液、 p H 6.8 和 Iml吉姆萨染液，放置于室温下。另外两个染缸中加入水用以洗脱，亦放置于室温下。 17. 从热水中取出一张玻片，在空气中晃动使其冷却并干燥，将其置于吉姆萨染液缓冲液中 3. 5min。依次将玻片移入另外两个盛水的染缸中，晃动玻片洗去残留的染液 (当染缸中的水变得有颜色时需换水），在空气中晃动玻片使其干燥。 18. 高倍非油镜下观察细胞染色质量（如 63X 或 80X )。明确判定至少在一些分裂相中姐妹染色单体是否可通过着色深浅不同加以区分。条件可以根据试剂的变化以及为了改进结果而微调（例如溶液的保存时间或试剂的批号，见表 8.4. 1) 19. 用适当的封固剂将制备最佳的染色体封固于盖玻片下。 20. 低倍镜工（如 16X ) 推片寻找分散良好且完整的分裂相，当找到一个好的分裂相时转换至尚倍镜（如 100X 或油镜）。鉴别姐妹染色单体着色是否不同，着色深浅的对比度是否能达到识别SC E的标准。扫视分裂相中每条染色体看其姐妹染色单体是否着色不同，以确定所有的染色单体片段均着色不同（即细胞在含B r d u 培养基中复制没有超过2 轮；见图 8. 4.1)。 21.记录有意义染色的第二次分裂的细胞位于玻片上的位置（即记录显微镜载片台上的坐标）。计数并记录染色体及SCE的总数。继续找出15个有意义的细胞并记录。判定 -个分裂相巾 S C E 醜酬職。选域 2 个最佳纟 _ 擺以紐 —步分析，采用如柯达T MaxlOO 专业胶卷那样高质量细颗粒胶卷。对于 S C E 发生率较高的分裂相，摄片（如打印）有助 • 确评分。在对分裂相进行拍照时，应在显微镜下对该翻再次审校，对比和确 = 换的位点， S C E 应赠笔在照片巾标出。直接轉复制和摄片相结合有助于确于着丝粒和端減其附近的減 SCE，且有助于 _发现靠在 —起的互换，如 Bloom综合征（ BS) 的特征。

来源：丁香实验

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