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        制 备 E B V 转 化 的 B 细胞

        相关实验:制备 EBV 转化的 B 细胞

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        基 本 方案

        材 料

        P M I - I O 完全培养基

        B 95-8 细 胞(绒猴细胞株; A T C C # C R L 1612),对数生长期
        外 周 肝 素 抗 凝 血(附 录 3 G ) ,扁桃体、脾脏细胞或骨髓

        P B S

        Ficoll-Hypaque 溶液

        H B S S

        lmg/m l 环 胞 素 A , 100% (V /V ) 乙醇配制,一 20°C 保存

        Beckman 4°C 离心机及 JS4. 2 转 子(或替代品)

        0.45um 滤器

        50m l 锥底离心管

        25c m 2 细胞培养瓶

        1•将I X l O 6个细胞/m l 对 数 生 长 期 的 B 95-8细 胞 接 种 到 R P M I -I O 完全培养基中。置 37°C , 5 % C 0 2细胞培养箱中培养3d 。确保活细胞> 9 0 % (附录3 0 。 2 , 细胞经 4°C , 300g 离 心 IOmin后 ,分 离 含 E B V 的 上 清 O l O 2〜IO3转化单位/ml)。 上 清 经 0.45/m i滤器过滤除菌,分装 , 一 130°C 可 保 存 1 年或更长时间。最好对病毒 上清进行滴定检测(Miller and Lipman, 1973)0 3•用P B S 将 约 15m l 外周肝素抗凝血进行I : 2 稀 释 。使用扁桃体或脾脏细胞时,需制 备 单 细 胞 悬 液 (单 元 7. 8),用 R P M I -I O 完全培养基调整浓度为5X I O 6〜I X I O 7个细 胞/m l 。使用骨髓细胞时,用 R P M I -I O 完全培养基将骨髓细胞1:20 (V A O 稀释。 4 . 在 50m l 锥底离心管中,将 12m l 稀 释 后 的 血 液 样 品 (或细胞悬液、骨髓)轻轻叠加 到 12ml Ficoll-Hypaque分离液上。室温, 1500g 离 心 8min,吸取界面层细胞,加入
        50m l 锥底离心管中。 5•加入适量P B S ,室温, 300g 离 心 15min,弃上清。用 H B S S 重 悬 细 胞 , 300g 离心 lOmin,弃上清。细 胞 用 H B S S 再 洗 涤 1 遍 ,加 入 2〜5ml R P M I -10完全培养基重悬 细 胞 并 计 数 (附 录 3A )。 6 . 在 50m l 锥底离心管中加入IO7个单个核细胞,总体积2. 5m l 。然后加入2.5m l 步 骤 2 中的病毒上清。 37°C 水 浴 2h 。 7 . 加 入 5m l 含 lMg/m l 环 胞 素 A 的 R P M I -I O 完全培养基。然 后 将 细 胞 悬 液 (约 IOml) 移 入 25cm2细胞培养瓶中。置 37°C , 5 % C 〇 2细胞培养箱中培养3 周 。培养期间在相 差显微镜下观察B 细 胞 转 化 情 况 (3 周左右时,细胞体积变大,聚集形成集落)。 8. 3 周后,混匀细胞,取 5m l细胞悬液加入新的25cm2细胞培养瓶中。每瓶再加入 5ml R PM I-IO 完全培养基,培 养 1 周 。此时可将细胞一 130°C冻 存 ,或 每 周 用 RPMI-IO 完全培养基将细胞按1 : 3 传代培养

        来源:丁香实验

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