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应用 APAAP 免疫染色和原位杂交进行序列的 MAC 分析实验

相关实验：应用形态学抗体染色体技术确定细胞的表型与基因型实验

最新修订时间：2024-05-13

原理

材料与仪器

实验材料	用于分析的空气干燥的细胞铺
试剂、试剂盒	PBS 5 % 的吉姆萨染液乙醇生物素或地高辛标记的重复序列探针 APAAP 底物溶液 FBS 氨水溶液甲醇冰乙酸固定剂甲醛缓冲的丙酮固定剂兔抗鼠Ig抗血清溶液 Harris苏木素染液
仪器、耗材	Coplin 缸过滤器细胞离心涂片器封片媒介过滤膜配有相机的显微镜保湿盒装有照相机的明视野显微镜

步骤

1. 固定空气干燥的细胞铺片用于分析，在装有4°C 甲醛缓冲的丙酮固定剂的Coplin缸中 Imin (细胞质和细胞膜结构必须完整）。 2. 在冷的自来水下冲洗2min。 3. 可任意选择的：除非膜抗原需要被研究以外，加 0.05% (m /V ) Triton X -100的 P B S 室温孵育lOmin，使细胞膜通透，用 P B S 冲洗玻片10min。 4. 在 TBS/F B S 的 Coplin缸中迅速漂洗，在另一 Coplin缸的TBS/F B S 中洗lOmin。 5•用cytospin Wter吸去玻片上多余的液体。 6. 在玻片上加15W 稀释的主要鼠抗人抗体，湿盒中室温孵育30min。重复第4、 5 步。 7. 在玻片上加15W 稀释的兔抗鼠Ig抗体（2 级或连接抗体，见图 4.7.2)室温下湿盒中孵育30min。重复第4、 5 步。

8 . 在玻片上加1 5 ^ 稀释的A P A A P 鼠免疫复合物，室温湿盒孵育30min。重复第4、 5 步。如果A P A A P 反应微弱，通过重复第7、 8 步增强信号。 9. 用 0.45|u m 过滤膜过滤 A P A A P 底物溶液，直接加在玻片上。室温下湿盒孵育 20min。冷自来水冲洗2min，室温下空气干燥过夜。玻片可用吉姆萨复染（第 10〜1 2 步）观察染色体形态，如不需要直接参见第 1 3 步。 10. 在 5 % 吉姆萨染液中复染IOmm，迅速在冷自来水下冲洗。 11. 用装有干燥100X 物镜的显微镜明视野下观察玻片（未封片），用微米级的显微镜摄像，并标记好阳性细胞的正确坐标。彩色玻片用 E k t a c h r o m e 64T (彩色反转片）观察。 12. 将玻片在 9 5 % 乙醇中浸泡 IOmin, 在 3 : 1 的甲醇/冰乙酸固定剂中 20°C 孵育 1〜12h 〇 13•按照以下方案预处理玻片： 37°C 0 •Olmol/L HCl 孵育 IOmin; 37°C 0. 1〜lm g/m 丨胃蛋白酶用0. Olmol/LHCl溶解孵育4〜IOmin; 室温下在装有蒸馏水的3 个 Coplin缸中逐一迅速漂洗。通过改变胃蛋白酶的浓度和处理时间使探针穿透达到最佳，也可见支持方案2〜4 的条件。 14. 室温下空气干燥lOmin。 15. 根据单元4. 4 基本方案第1〜8 步的叙述将生物素或地高辛标记的重复序列探针 (用于同期或相继的检测）与玻片杂交。也可应用单拷贝或全染色体涂染探针（所需的序列检测）。酶的检测 16a. 根据单元4. 4 备选方案1 的叙述用酶检测生物素（酰）化的探针（也可应用其他方法）。 17a. 室温下苏木素染色30s ，迅速地在0.0025% (V A O 氨水中冲洗，室温下水迅速冲洗。 18a. 用 Entellan或细胞遗传学标准的封片媒介封片，不能应用Entellan进行同期分析，因为可能会消除A P A A P 的反应产物。 1 9 a .应用 IOOX油镜观察玻片并用它给在第11步当中的同一区域拍照。荧:光素检测 16b. 按照单元4.4 基本方案第8〜11步的叙述过程和单元4. 4 支持方案1 或 2 的详述用荧光素检测杂交的生物素标记的探针。 17b. 用 D A P I 或者 P r o p i d i u m复染用荧光素标记的样品（参见单元4. 4 基本方案第12、 13 步)。 1 8 b .用抗淬灭的封片媒介封片。 1 9 b .用 IOOX物镜观察玻片进行分析，并对第H 步当中拍照的同一区域进行分析。

备选方案1 应用基于H R P 的检测进行免疫分型应用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， H R P ) 可以检测联合的主要抗体，而取代A P A A P 法，但用此法检测联合的主要抗体（图 4. 7. 3 ) 较 A P A A P 法花费的时间更长，但一些抗体（如抗B 细胞标记）实际上用此法更好检测。另外，免疫过氧化物酶比间接的免释荧光法更灵敏。免疫过氧化物酶表型和原位杂交的信号，可以同时或相继用于酶的或美光的探针的检测。附加材料（见基本方案1 ; 标V 的条目参见附录1) 1 % ( W V ) H 2O 2 的甲醇 V 丙酮/甲醇固定剂 P B S / F B S : 0 . 0 8 % 、 0 . 2 % 和 5 % ( V / V ) 灭菌过滤器（ 1.2广过滤器） F B S 的 P B S 正常马血清按 1 : 5 0 稀释的 P B S / 5 % ( V / V ) F B S 鼠抗人主要抗体用P B S / 5 % O V V ) F B S 按 I : 10〜1 : 5 0 稀释生物素化的抗鼠I g G 二级抗体按 1 : 2 5 0 的 P B S / 5 % ( V / V ) F B S 稀释 A B C k i t (Vect a s t a i n )含有亲合素D H 和生物素化的辣根过氧化物酶H ( H R P ) V 免疫过氧化物酶底物溶液 1• 如果需要，贝樋过用 1 % (V /V ) H 2O2 的甲醇室温下玻片孵育30m in 封闭内源性过氧化物酶的活性。 2 . 将存有细胞的已空气干燥的玻片置于4°C丙酮/甲醇固定剂的CopHn缸中I m in ,迅速地在冷自来水下冲洗玻片2〜 3min。 . 3. 任意选择：除非膜抗原需要被研究以外，加〇.〇5% (m /V ) Triton X -100的 P B S 室温孵育lOmin，使细胞膜permeabilize，用 P B S 冲洗玻片lOmin。

4. 在 P B S/O.0 8 % F B S 的 Coplin缸中迅速漂洗，用 cytospin filter吸去玻片上多余的液体，使细胞保持湿润直到第10步。 5. 在玻片加2 5 4 稀释的正常马血清，湿盒中室温下孵育30min，除去过剩的马血清，迅速吸干玻片。 6. 加 2(^1鼠抗人主要抗体，湿盒中室温下孵育lh。迅速在PBS/0.2%F B S 中冲洗，在新鲜PBS/0.2%F B S 冲洗lOmin，吸干玻片。 7. 加2〇4生物素化的抗鼠IgG二级抗体，湿盒中室温下孵育30min，冲洗及干燥同第 6 步。 8 . 等体积混合亲合素D H 和生物素化的辣根过氧化物酶H 形成亲合素-生物素复合物，混合物按1 : 160用 PBS/ 5 % F B S 稀释。 9. 加 20^1亲合素-生物素复合物，湿盒中室温下孵育30min。迅速在P B S/0. 2 % F B S 中冲洗并干燥。 10. 在装有免疫过氧化物酶底物溶液的Coplin缸中室温下孵育20min。迅速在装有PBS 的 Copliri缸中冲洗，随后迅速在装有蒸馏水的Coplm缸中冲洗，室温下空气干燥过夜。、 11.用吉姆萨复染玻片（可选择：基本方案1，第 10〜12步）和进行原位杂交（基本方案 1，第 13步之前)。应用标准的细胞学封片媒介并且用100 X 干燥物镜观察玻片，因为EnteUan和浸入的油都可能消除棕褐色的反应产物。. 备选方案2 应用荧光素检测进行免疫分型免疫荧光分型可以通过酶的或荧光素的原位杂交探针的检测用于连续的或同期的分析。另外，尽管该方法较A P A A P 和 H R P 灵敏性稍差，但比后两者快速，并且通过仔细选择荧光素能够对免疫荧光分型结果进行同期检测。单拷贝和重复序列探针适用于间期核的原位杂交，而全染色体涂染探针则适用于中期核的原位杂交。附加材料（见基本方案1 ; 标V 的条目参见附录1) V 丙酮 /甲醇固定剂 PBS/FBS: 0. 2 % (V /V ) 过滤灭菌 FBS、 PBS 鼠抗人主要抗体用PBS/0. 2 % F B S 稀释至I : 10〜1 :30 荧光素偶联的羊抗鼠IgG二级抗体（Cappel) 用 PBS/0.2X F B S 稀释至1:200 公0.5% (m /V ) 奎纳克林氟安定 1. 空气干燥的细胞玻片在4°C 的丙酮/甲醇固定剂中固定lmin，在冷自来水下冲洗 2〜3min0 2 . 可选择的：除非膜抗原需要被研究以外，加 0.05% (m /V ) Triton X -100的 P B S 室温孵育IOmin, 使细胞膜permeabilize，用 P B S 冲洗玻片IOmin0 3 . 迅速在PBS/0.2%F B S 中漂洗，吸干玻片上的液体，使玻片保持湿润直到完成所有方案。 4•加2〇4稀释的鼠抗人主要抗体，湿盒中室温下孵育30min。在新鲜PBS/0.2% F B S 迅速冲洗2 次，吸干玻片。

5 . 加 20； ul稀释的荧光素偶联的山羊抗鼠IgG二级抗体，湿盒中室温下孵育30min，迅速在PBS/0.2%F B S 中漂洗，并吸干。 6. 用 0.5% (m /V ) 奎纳克林氟安定复染IOmin进行荧光原位杂交前先进行Q 带评价。 7a. 用于连续的分析：用装有合适滤片的荧光显微镜观察玻片，去处荧光素（基本方案 1，第 12步）进行原位杂交（基本方案1，第 13步前） 7b. 用于同期分析：直接用于原位杂交（基本方案1，第 13步前）。除了应用于免疫表型外可以应用不同荧光素的荧光探针。备选方案3 染色体C 带或 G 带基因型细胞离心图片器和原位培养（支持方案1 和 2 ) 的应用可以得到中期染色体，通过单元4.3 (图4. 7. 4 ) 中所述的染色体显带技术能够进行基因分型。任何一种显带技术均能同时用于表型分型的技术。当'免疫荧光表型分型被完成，免疫染色后不需要任何再固定， Q 显带技术也可被应用。但 G 显带和C 显带还有姐妹染色单体互换则需要酸性再固定。 G 显带和C 显带需要用明视野显微镜观察，并可以同A P A A P 和 H R P 免疫染色相结合。如果需要的话，在显带后还可进行原位杂交（基本方案2)。选择样品 2h Ficoll-Paque密度梯度离心细胞培养抑制有丝分裂 >■标本制备 5min 低渗处理彡10min 细胞离心涂片器 12h 空气干燥 5h A P A A P 、 IP或 IF处理 10min 染色体复制 > 表型 1h 显微镜观察和照相 (粗糙的染色体分析） 2h 固定剂去除 A P A A P 和吉姆萨彡1h G 显带 /C显带彡1h 显微镜观察 ' 卜基因型 2h 固定剂去除吉姆萨 30min 原位杂交预处理 24h + 原位杂交 J 图 I 7 . 4 用于序列 MAC分析的染色体显带技术大纲及所需时间，实线表示必须执行的方案，虚线表示选择性的方案。附加材料（见基本方案1) ^ 胞来源于细胞离心涂片器或原位培养制备（支持方案1 和 2) 6〇。〇烤箱

1.应用A P A A P (基本方案1，第 1〜10步)、 H R P (备选方案1 ) 或免疫荧光（备选方案 2 ) 等方法对细胞离心器或原位培养的细胞进行表型的检测。 2. 将玻片在装有9 5 % 乙醇的Coplin缸中孵育lOmin。 3. 将玻片在装有3 : 1 的甲醇/冰乙酸固定剂的Coplin缸中 20°C 孵育 1〜12h 。 4. 60°C 烤箱中空气干燥18〜24h 。 5. 完成G 或 C 显带（单元4. 3)。对于G 显带则要增加一步胰酶消化lOmin。 6. 可选择：执行原位杂交（基本方案2)。支持方案1 细胞离心涂片的制备具有分裂活性的细胞用促有丝分裂剂处理，以增加中期染色体的数量（图 4.7.5); 如细胞不具有分裂活性（如纯化的粒细胞）或者间期细胞需要被分析，促有丝分裂剂的刺激被消除。悬浮细胞应用细胞离心图片器制备优于滴片或是空气干燥细胞（单元 4 . 1 ) 和涂片等方法的制备。培养介质 ¥ KJ 管 2 1 ~ 3ml培养介质 0.8 ml -细胞- W 培养介质 - 细胞沉淀 - 3 ml -1.2 ml- 管 1 管 3 细胞悬液 (0.8X 106〜 1.5X 106 个细胞 /ml) 10 ml KJ 管4 底渗溶液细胞离心涂片器盒玻片 ■ 80-150 [il KJ 管 5 室温孵育 5 min 参照图 4.7.6 图4.7.5 渗处理及细胞涂片制备的图示。材料（标V 的条目参见附录1) 样本(如肝素抗凝血、骨髓、悬浮肿瘤细胞）或培养的细胞（悬浮培养或胰蛋白酶作用的单层细胞）外周包裹有所需抗体的免疫磁珠（如 Dynal Dynabeads M-4： 50、 Miltenyi Biotec M iniM ASCO;可任意选择）促有丝分裂剂： 12-0四葵酸佛波乙酯（12-〇-tetradecanoylphorbol-13-acetate;

T P A ， Sigma; 针对B 淋巴细胞）、植凝集素（ P H A ， Sigma; 针对 T 淋巴细胞）或其他促有丝分裂或生长因子（可任意选择）秋水仙酰胺（可任意选择） ^^/^〇低渗溶液， 20°〇 5〇 m l 组织培养瓶（ Nunc) IOml —次性聚丙烯圆锥底离心管细胞离心涂片器（Shandon， Lipshaw) 乙醇洗净的玻片细胞离心涂片器过滤器（ Shandon、 Lipshaw) 1 . 如果必须应用Fic0Il-Hypaqu e 密度梯度离心（单元 10. 3 ) 或葡聚糖沉降法从标本中除去红细胞。如必须进一步去除单核淋巴细胞可进一步利用包裹有适合抗体的免疫磁珠分离细胞亚族。 2. 用完全R P M I /20% F B S 重悬单核细胞使之密度为IO6个/m l ，力卩 5〜IOml细胞悬液到 50m l 组织培养瓶。如果需要在组织培养瓶中加人促有丝分裂剂以增加中期分裂相的数目（如 O.Sjug/m I P H A 针对T 淋巴细胞、 Z^g/m l T P A 针对B 淋巴细胞在慢性淋巴组织发育阻碍白血病中）。 3. 在 37°C ， 5 % C 〇2 温箱中培养12h 至 4d。 4. 为了得到分裂中期染色体，培养一开始即加入终浓度为的秋水仙酰胺（针对骨髓细胞）或在指数增长期加入（针对其他类型细胞）。继续 37°C 培养 12h ，选择最佳条件，如果需要可延长培养时间或者用髙浓度秋水仙酰胺以达到最大数目的分裂中期相，但作用时间要短，以免影响染色体形态，如长度及带型。 5. 将细胞和培养基转移至IOml—次性聚丙烯圆锥底离心管（图 4. 7. 5 中的管1)，室温 180g 离心 lOmin。将上清倒人另一管中（图 4. 7. 5 中的管2 ) 并保存。 6. 重悬离心的细胞沉淀物，并用血细胞计数器（附录31)计数，加人足够上清液使细胞悬液浓度为〇.8X 106〜I.6X 106个/ml (图4. 7. 5 中的管3)。 7.将 1.2m l 细胞悬液（足够12张玻片) 转移至IOml—次性聚丙烯圆锥底离心管（图 4.7.5中的管5 ) 中，加入0.8m l 低渗液并混合U X l O 5〜7.5X IO5个/m l 终浓度）。室温下5min。应用第6 步的悬液或相同的粒细胞悬液、培养悬液细胞或用蛋白酶处理的单层细胞。间期细胞的置备不需加促有丝分裂剂。 8. 装好细胞离心涂片器、乙醇清洁的玻片细胞离心涂片滤纸备用。将 80〜1504低渗细胞悬液转移至细胞离心涂片器盒室温离心5〜lOmin。 9. 需额外的玻片，则重复第7 和 8 步，准备一次使用完的细胞悬液量。每次实验备用 10〜20张清洁玻片。 10. 室温空气干燥12h 细胞离心涂片器制备的玻片（图 4.7. 6)。室温下至多3 周，或一20°C 或一7〇°C 保存用于M A C 表型、基因型分析（涂片室温下保存2〜5d 最佳）。如果是冰冻保存的涂片则室温空气干燥10〜24h 即用于细胞免疫化学处理或用于原位杂交。

支持方案2 原位培养的准备 M A C 低渗溶液可以直接应用于单层细胞。因为间期细胞在酶的消化和洗涤过程中不会丢失'，并且胰蛋白酶敏感抗原不会受影响，如果单层肿瘤细胞数目（IO4〜IO5个) 和分裂指数都较低，该操作方法是较合适的。材料（标V 的条目参见附录1) 黏附细胞（如肿瘤组织或细胞、成纤维细胞） V 完全 RPMI/20% F B S 蛋白水解酶（针对活组织）秋水仙酰胺 V M A C 低渗溶液 0. 01mol/L H C 1, 37〇C 胃蛋白酶：〇.1〜l m g / m l 溶解在O.Olmol/L H C l 中， 37°C 15m l 培养瓶 1 . 准备浓度约为3. 3 X 105个/m l ，用完全RPMI/20% F B S (支持方案1，第 1 和 2 步，附录31)作媒介的细胞悬液，针对肿瘤活组织，首先在完全RP M I /20%F B S 中切碎样品并补充蛋白水解酶易于组织裂解。 2 . 在 15mi flaskette chamber slide中培养直到细胞形成非重叠的单层或者可以观察到有丝分裂指数

3 . 加入秋水仙酰胺至浓度为〇.4^gAnl继续孵育12h (支持方案1，第 4 步为最佳条件) 4•倒出2m l 培养液与 2ml M A C 低渗溶液混合，将混合物重新倒入培养瓶 2〇c 孵育 5min。 5•倒出低渗溶液，将玻片从盒中取出。 6 . 室温空气干燥玻片2d ，按照支持方案1，第 10步保存。 7 . 免疫化学和细胞化学表型分析后，通过原位杂交进行基因型分析，除去反应产物 (基本方案1，第 12步）并按以下方案处理玻片（逐一应用直到最优化条件）： 0. 01m o l / L H C l 37°C 鮮育 10〜30min; 0. 1〜I m g 胃蛋白酶/ m l 0. 01m o l / L H C l 37°C孵育 10〜30min; 在水中冲洗3 次。每次用一张玻片以确定最优化的酸处理时间和胃蛋白酶浓度及处理时间。 8. 执行酶的或荧光的重复序列，或单拷贝，或全染色体涂染探针原位杂交的检测。支持方案3 组织切片的制备从原则上说所有免疫染色的方法均适合石蜡和冰冻切片。对表型和原位杂交信号的同期和连续的分析都是适合的。切片能够从组织学和形态学对细胞特征迸行描述。因为 2 或 3 连续的切片代表了组织或肿瘤的同一块区域，如果不需要在单细胞水平上分析，那么一块切片用做表型分析，另一块切片用做基因型分析。如果切片先前未进行过表型分析原位杂交能够在切片上产生较好的结果。因为仅有间期细胞被分析，重复序列和单拷贝探针被应用于杂交。材料（标V 的条目参见附录1) 5jLim石蜡包埋或冰冻组织切片二甲苯浓度梯度乙醇： 7 0 % 、 9 5 % 、 1 0 0 % 乙醇 1 % (V /V ) H 2O 2 甲醇二甲苯 1 0 0 % 甲醇 lmol/L硫氰酸钠72°C 0.01〜0 •I m o V L H C 1， 37〇C 1〜5m g / m l 胃蛋白酶溶解在H C 1， 37°C V 多聚左旋赖氨酸涂层的显微镜玻片 60°C和 70°C烤箱 1•将5p m 的石蜡包埋或冰冻组织切片固定在多聚左旋赖氨酸涂层的显微镜玻片上，如果应用冰冻切片，执行第4 步。 2.将玻片置60°C烤箱中过夜。 3•通过用二甲苯孵育玻片3 次，每次 IOmin除去石蜡。 4•在1 0 0 % 、 9 5 % 、 7 0 % 乙醇各孵育5m i n ，室温空气干燥12〜24h D 5.任意选择：如应用 H R P 进行表型的分析，封闭内源性过氧化物酶（如必须）可通过室温下将玻片在 O V V ) H 2O 2 甲醇孵育30m i n 。在甲醇中漂洗5m in ，室温空气

干燥 12〜24h 。 6a. 石蜡包埋的组织切片的基因型：除去表型的染色（基本方案1，第 12步；同期分析则跳过）按照以下处理： 72°C lm o l/L 硫氰酸钠孵育IO m in; 37°C 0. 0〜0. lm o l/L HCl 孵育 IOm in; 37°C 1〜5m g/m l 胃蛋白酶的 0. 01〜0. lm o l/L H C l 孵育 10〜30min; 用水洗3 次。每次用一张玻片以确定最优化的酸处理时间和胃蛋白酶浓度及处理时间。用相同浓度含有胃蛋白酶或不含的H C l洗片。 6b. 冰冻切片的基因型：除去表型的染色（基本方案1，第 12步）按照以下预处理： 72°C lm o l/L 硫氰酸钠孵育5m in ; 37°C 0. 01〜0. lm o l/L H C l 孵育 IO m in; 37°C 1〜5m g/m l 胃蛋白酶的 0. 01〜0. lm o l/L H C l 孵育 10〜20min; 用水洗3 次。每次用一张玻片以确定最优化的处理时间。 7.执行原位杂交（基本方案1，第 14 步前）应用重复序列或单拷贝探针。支持方案4 血液和骨髓涂片的制备制备好的涂片（图 4.7. 7)要迅速但又必须熟练，血液和骨髓涂片同冰冻切片一样能应用于连续的免疫表型和基因型分析；但是涂片不含有分裂中期细胞，所以它不能等同于促有丝分裂冰冻切片的制备。

1 . 将一滴肝素抗凝的血液或骨髓滴在玻片的右缘。 2•取第二张玻片（涂布器）置于液滴的左缘。 3. 将涂展玻片成40°角接触液滴使液滴沿着边缘展开。 4•向左推动玻片使液滴铺展在第一张玻片上。 5. 室温下空气干燥玻片1〜2h 。 6. 应用原位杂交对涂片进行基因型分析，除去表型的染色（基本方案1，第 1 2 步）按照以下预处理： 37°C 0. lmol/L HCl 孵育 IOmin; 37°C 0 •1〜lmg/ml 胃蛋白酶的 0. 01mol/L HCl I浮育 1〇〜30min; 用水洗3 次。每次用一张玻片以确定最优化的酸处理时间和胃蛋白酶浓度及处理时间。 7. 执行原位杂交（基本方案1，第 14步前）应用重复序列或单拷贝探针

来源：丁香实验

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