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基本方案2 四重 PCR 的引物延伸法

相关实验：使用引物延伸荧光偏振探测法的高通量基因分型实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	目的基因组DNA
试剂、试剂盒	PCR 引物混合液 Taq DNA 聚合酶 10XPCR扩增缓冲液 4dNTP 混合液 AcydoTerminator混合液
仪器、耗材	384孔 PCR 板封口垫 FP 读板设备多管移液器或液体操作工作站带加热盖的热循环仪 384孔透明 PCR 板和黑色 PCR 板

步骤

1•用多管移液器或液体操作工作站为384孔透明P C R 板每孔加8 M 0. 8叫/一的基因组 D N A 。孔板于室温下用benchtop离心机以500g短暂离心，接着室温下空气干燥过夜。将孔板叠放并用塑料膜包裹保存于真空干燥器备用。 2 . 每个 384孔板配制一份母液，包含： 45〇 4 IOX P C R 缓冲液； 630|ul 25mmol/L M g d ; 18Cyl 2. 5mmol/L 4 d N T P 混合液； 18jlJ 5U/jnl Platinum Tag D N A 聚合酶； 522“ H 20 。含干燥的基因组D N A 的每孔加4^1母液。 3 . 加 7jul P C R 引物混合液到P C R 反应混合物。用封口垫封上孔板，室温下以500g短暂离心。用下面的热循环条件进行热启动P C R 。 1 个循环： 2min 95〇C (变性） 3 5个循环： IOs 92〇C (变性) 4 0 个循环： 20s 58〇C (复性) 30s 68〇C (延伸） 1 个循环： IOmin 68°C (最后延伸) 最终步骤：无限 4°C (维持） 5 . 用 1 8 0 0 M 水稀释20(V 10 X Exo-SAP-IT P C R 纯化剂，力 W jlJ 这种 I X 反应物到P C R 产物混合液。用封口垫封上孔板，室温下以500g短暂离心。 37°C温育 lh。 8(TC加热 15min灭活酶。反应混合物降温至4°C并维持至下一步骤。 6 . 在一个 3 8 4 孔黑色 P C R 板中每孔加 IOjlJ 〇 .Zjamol/L S N P 引物。将 3jul处理过的 P C R 产物（来自第5 步）移入孔板上的各孔。

7 . 准备一份含下列试剂的母液： 9004 10X反应缓冲液； 11. 25^1 AcycloPol D N A 聚合酶； 76. 5jul AcycloTerminator 混合液； 2162. 25/J H 2CX 每孔加7M 1到第6 步准备的孔板。用封口垫封上孔板，室温下以500g 短暂离心。 8. 用下面的热循环条件进行引物延伸反应。 1 个循环： 2min 95°C (变性） 2 0 个循环： 15s 95°C (孪性) 30s 55°C (延伸）最终步骤：无限 4°C (维持；避光) 9.依照相应生产商的指示，使用 Victor2、 Analyst、 Ultra或 EnVision等 F P 读板设备

来源：丁香实验

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