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基本方案1 单重 PCR 的引物延伸法

相关实验：使用引物延伸荧光偏振探测法的高通量基因分型实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

实验材料	目的基因组DNA
试剂、试剂盒	SNP 引物 10 X PCR 缓冲液 Taq DNA 聚合酶 4dNTP 混合液
仪器、耗材	384孔 PCR 板封口垫 FP 读板设备 384孔黑色 PCR 板多管移液器或液体操作工作站带加热盖的热循环仪

步骤

1. 用多管移液器或液体操作工作站为384孔 P C R 板每孔加 0. 8ng/jLj的基因组 D N A 。孔板于室温下用benchtop离心机以500g 短暂离心，接着室温下空气干燥过夜。将孔板叠放并用塑料膜包裹保存于真空干燥器备用。 . 2. 每个孔板配制一份母液，包含： 225/^J IOX P C R 缓冲液； 315^1 25mmol/L MgCl2; 9〇4 2. 5mmol/L 4 d N T P 混合液； 9/lJ 5U/juJ Platinum Tag D N A 聚合酶； 711M H 2O 0 含干燥的基因组D N A 的每孔加3M1母液。 3. 加 3/xlP C R 引物混合液到P C R 反应混合物。用封口垫封上孔板，室温下以5〇〇 g 短暂离心。 4. 用下面的热循环条件进行热启动P C R 。 1 个循环： 2min 95°C (变性） 3 5 个循环： IOs 92°C (变性）

4 0 个循环： 20s 56°C (复性） 30s 68°C (延伸） 1 个循环： IOmin 68°C (最后延伸) 最终步骤：无限 4°C (维持） 5 . 用8 1 ( V 水稀释％ a 10 X Exo-SAP-IT P C R 纯化剂，加 2^1这种 I X 反应物到PCR 产物混合液。用封口垫封上孔板，室温下以5 00g短暂离心。 37°C温育 lh。 80°C加热 15min灭活酶。反应混合物降温至4°C并维持至下一步骤。 6 . 准备一份含下列试剂的母液： 2254 10 X 反应缓冲液； 11. 25一 AcycloPol D N A 聚合酶； 225jul AcycioTerminator 混合液； 1113. 75(lJ H 2〇。每份产物加3“ 母液。 7 . 每孔加8/^ljumol/LSNP引物。用封口垫封上孔板，室温下以500g短暂离心。用下面的热循环条件进行引物延伸反应。 1 个循环： 2min 95°C (变性) 2 0 个循环： 15s 95°C (变性) 30s 55°C (延伸) 最终步骤：无限 4°C (维持；避光) 8.依照相应生产商的指示，使用 Victor2、 Analyst、 U ltra或 EnVision等 F P 读板设备确定反应混合物的F P 值。将两种染料的F P 值导人电子制表软件（如 Microsoft Excel) 或 SNPScorer，生成散点图。根据每个样本在散点图中的位置指定基因型

来源：丁香实验

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