基本方案1 PCR扩增单精子遗传标记实验

最新修订时间：2024-05-13

原理

从琼脂糖薄膜分离的已裂解的精子（支持方案1)，或流式细胞计量术（支持方案 2)，或 PEP产物（支持方案4) V 中和缓冲液 V IOX扩增缓冲液（含钾离子）和 IOX扩增缓冲液（不含钾离子） V 2mmol/L 4 d N T P 混合液 lOO^mol/L 第一套引物（支持方案3; —20°C保存）：正向和反向 5U //jJ Tag DNA 聚合酶（ Perkin-Elmer, Promega) 轻质液体石蜡油 lOOjumol/L第二套引物（支持方案3; —20°C保存）：半巢式或巢式（如果是半巢式，则第一套引物中的正向或反向引物这里也被用到，取决于巢式引物的位置） 9 6 孔 P C R 仪（如 PTC-200; M J Research)和 9 6 孔板或离心管注意：所有的试剂应用超纯水配制。

材料与仪器

试剂、试剂盒	10X扩增缓冲液轻质液体石蜡油 Taq DNA 聚合酶中和缓冲液 4dNTP 混合液
仪器、耗材	96 孔板或离心管 PCR 仪

步骤

la. 从琼脂糖薄膜分离的单个精子：准备第一轮P C R 的试剂，每个PC R 管或96孔板的每个孔已加有5. Oyl裂解液，精子悬浮其中，再加入以下试剂： 5. Ojul中和缓冲液； ’ 5. OjUl 10 X 扩增缓冲液（不含钾离子）； 2. 5|ul 2mmol/L 4 d N T P 混合液； 2. Opl lp m o l/y 单向引物（由 lOOpmol/L储存液稀释而来）； 0. Ip l 5U/W T 叫 DNA 聚合酶；加水至总体积5(^1。 lb. 经流式细胞仪获得的已被裂解和中和的单精子：如 I a 描述的准备反应，但把中和缓冲液换成水。 lc . PEP (引物延伸预扩增）产物：每个 P C R 管或滴定板的每个孔依次加入各种PCR 试剂，再加入P E P 反应产物2〜 (或是其他实验经验值）。如 I a 中的步骤准备 PCR试剂，但改用含有钾离子的10X 扩增缓冲液，并把中和缓冲液换成水。 2.如果PCR 仪没有配置加热盖，那么每个孔应覆盖一层轻质液体石蜡油，以防止蒸发。按以下方法进行第一轮PCR 扩增（优化了的多重PCR 可以同时扩增16个不同的位点，也就是32条引物）。第一步： 3min 94〇C (变性) 1 个循环： 2min 55〇C (复性) Imin 720C (延伸)

4 个循环： 15s 95〇C (变性) Imin 55〇C (复性) Imin 72°C (延伸) 35个循环： 15s 95°C (变性) 30s 55〇C (复性) 30s 72〇C (延伸) 最后一^步：无限期 4°C (保持) 3 . 准备第二轮P C R 扩增反应试剂： 2. 5^1 IO X 扩增缓冲液（含钾离子） 2. OjUl 2mmol/L 4 d N T P 混合液 I. ( V 10. O p m o l / y 单向第二轮引物（由 lOOpmol/L储存液稀释而来） 0. Ijul 5 U / V Tag D N A 聚合酶加了第一轮PCR 反应产物（1〜2^1)后，用水调整总体积至25jul。 4 . 取一新的96孔 PCR板，每孔加足量的第二轮PCR 反应试剂，保证总体积为25“。每孔再加入1〜2 4 第一轮PC R 反应产物。如果必要，每个孔覆盖一层轻质液体石蜡油。按以下方法进行第二轮PCR 扩增（应根据特异性引物的不同组合调整复性温度/时间）。第一步： 3min 94〇C (变性) 3 5个循环： 15s 95〇C (变性) 30s 55〇C (复性) 30s 720C (延伸) 最后 '步：无限期 4°C (保持) 如果需要，样品无限期4°C 保存（直至分析完成)。 5 . 用现成的通用方法确定S S L P 或 S N P 标记等位基因状态（如非变性P A G E )。

支持方案1 从琼脂糖薄膜分离单个精子材料（标V 的条目参见附录2) 精液 _ 0 . 5 % ( m / V ) 低熔点琼脂糖 V 细胞裂解液 V 中和缓冲液（可选的）凝胶成样器和电泳仪（如 Hoefer 200系列) 倒置相差显微镜1〇〇 x 物镜 Paragon 11 号手术刀片（Maersk Medical) P C R 管立体显微镜4. 6 X 物镜 65°C水浴或热循环仪

注意：工作应尽可能在层流通风橱内完成，以减少污染。应严格遵守标准无菌操作。 1 . 将2〜IOjUl精液（根据实际精子浓度）与 20ml 0.5% C m A O 低熔点琼脂糖混合。将 2ml凝胶倒人一个I O c m X I O c m 玻璃板中，轻轻移动玻璃板以使凝胶的厚度为1 〜 2 m m 。如果必需，优化精子浓度以提高挑选单精子的效率。 2 . 琼脂糖凝胶置于37°C、 2 0 m m ，直至完全凝固。 3 . 将玻璃板放在倒置相差显微镜100X 物镜下。用 P arag0n 1 1 号手术刀片切下一块含单个精子的琼脂糖凝胶，斜切角度与水平轴呈30°〜4〇°。选择靠近琼脂糖凝胶边缘的精子（这里的琼脂糖还未完全脱水），切下的胶块的直径10倍于精子D 4 . 将胶块移入一已加有5^1细胞裂解液的PCR管中， PCR管固定在立体显微镜4. 6 X 物镜下。在显微镜下观察以确定胶块完全浸没于裂解液中。确定 9 6 孔板中胶块的浸没情况比单个P C R 管难得多。 5. P C R 管于65°C温育10〜15min。裂解产物立即进行第一轮P C R (基本方案1 )，或加入 5“ 中和缓冲液，盖上管盖，一20°C保存备用。支持方案2 用流式细胞计量术分离已裂解了的单精子细胞材料（标V 的条目参见附录2) 基因分型供者的精液 5哗/1111 Hoechst 33342 (—种 DNA的特异荧光染料） 7 0 % (m/V) 蔗糖携带 Hoechst 33342 的突光微球（ Flow Cytometry Standards) 10% (WV) 次氯酸钙（次氯酸钠；如 Clorox) V 细胞裂解液 V 中和缓冲液 Biosonik DI超声波细胞打碎机带 4-mm 探针（Brownwill Scientific) 相差和突光显微镜 FACStar Plus 变光活化细胞分选仪（ BectonDickinson) 灵活的9 6 孔微量滴定板（如 Falcon)或 9 6 管体系（如 GeneAmp P C R System 9600% Perkin-Elmer Cetus) 与 96孔微量滴定板或％管体系相容的65°C水浴或热循环仪注意：所有的试剂应用超纯水配制。注意：工作应尽可能在层流通风橱内完成，以减少污染。应严格遵守标准无菌操作。 1. 将 lOOjul基因分型供者的精液与5 0 0 4 水混合于一 1. 5 m l 微量离心管中。室温下 883尽离心Imin沉淀精子。弃上清，加 50(^1水，使精子重悬于水中。 2 . 用带4mm探针的Biosonik HI超声波细胞打碎机以最低强度处理细胞悬液（或其他仪器的其他强度），使精子去尾。 3. 室温下883g 离心 Imin沉淀精子。弃上清，加 500W水，使精子重悬于水中。

4 . 在相差显微镜下检查一小部分精子以确定完全去尾。如果必要，重复第2 、 3 步。短尾的精子（也就是，尾部的长度是头部的1/4) 没有问题。长尾的精子被认为会阻塞细胞分选仪的喷嘴。 5•至温下883g•离心Imin ?几淀精子。弃上清。沉淀重悬于100^1 5jitg/ml Hoechst 33342 中。 37°C孵育 1 〜24h。当精子样品很少或为了限制细菌繁殖带来的污染，可减少染色时间。 6. 室温下883g 离心Im in沉淀精子。弃上清，沉淀重悬于2(%1水中。以和第2 步相同的强度处理细胞悬液5s 以减少凝集。 7.加 2004 70% (m/V ) 蔗糖后立即分选（第 10步），或一20°C 保存1 年（或更长）备用。 8. 用携带Hoechst 33342的荧光微球调整FACStar Plus荧光活化细胞分选仪，使突光信号的强度达到最强。调整控流设置使每一分选液滴中只包含一个珠子的量。 9. 分选几排单突光到显微镜的玻片上，通过荧光显微镜，检查分选可以使每二分选的液滴中仅包含一个珠子的量，确认仪器和控流设置的调整。如果不是，重新调整控流设置。 10. 用水或10% (WV) 的漂白剂和随后的水从仪器中冲洗珠子，直至没有焚光信号出现。保证漂白剂完全被清除。 11. 准备分选时，用水稀释部分染色的精子至100倍（或者调整流速使精子数量达到分选窗的标准也是约1 个细胞/s)。将这些精子的样本加入，然后重设分选窗口，在水平轴上使用边缘散射点，在垂直轴上使用荧光信号，这样可以使主要的单精子部分在分选窗口中，而两个或多个的精子团则可以被排除。 12. 分选数排单精子到显微镜载玻片上。用焚光显微镜检查分选结果的确是在液滴中是单精子。分选过程中固定时间重复此确认步骤，使控流设置保持稳定，单细胞能够得到保存。 13. 在层流通风橱中，将 SjUl新鲜混合的细胞裂解液加入到柔软的9 6 孔微量滴定板或 96管系统的管中。分选单精子到每一含溶液的孔或管中。在 3 个孔或管中分别加入 20个精子，另 8 个孔或管中不加入任何精子作为阳性和阴性对照。如果许多精子样品被分选，对流式系统的全方位冲洗将是#常必要的（如第 1〇步），这一在分选前的步骤将可以减少交叉污染的机会。 14. 结束后，用 1 0 % 漂白剂冲洗然后用> 5mi 的水冲洗仪器。 15.将分选的精子在5^x1细胞裂解液（第 13步）65°C 中孵育10〜15min，可以使用水浴 fe或适合微量滴定板和96孔系统的热循环仪。反应结束后加入5 4 中和溶液，用石蜡膜好微量滴定板，最后在一20°C 可保存数月且随时可以使用。支持方案3 多重扩增单精子细胞精子分型依赖于对目的D N A 分子的有效扩增，通常需要两轮P C R 以获得足够量的特异性=物，产物经电泳后用溴化乙锭染色检测。要确保所有靶位点在多重扩增中都可以得到尚效扩增，引物的设计是很重要的，引物要有相近的退火温度，同时还要避免引物和它同一位点的引物或其他位点的引物形成引物二聚体。当需要扩增大量位点时

$要避免引物间的相互作用就变得相当棘手，作者通常通过仅扩增同一位点上的配对引物来寻找可能的引物二聚体。采用这一方法，曾成功地同时扩增多达16个位点，并且所有位点的扩增效率都在9 0 % 以上。其他可以优化单细胞多重扩增效果的因素有低引物浓度和PCR第一个循环中可变的退火和延伸温度（基本方案1，第一轮PCR)。其他用于多重扩增的策略还包括采用带有5'通用末端的基因座特异性引物。支持方案4 采用引物延伸预扩增（ P E P ) 技术对单个细胞D N A 进行全基因组扩增引物延伸预扩增（ PEP) 是一种可以用于单精子全基因组扩增的方法。附加材料（基本方案1) 400mmol/L Poly N 15个碱基的随机引物（操纵子）冻存于96孔微暈滴定板的已分选、裂解并中和了的单精子（基本方案1) 注意：所有的试剂应用超纯水配制。 1. 准备以下PEP试剂（进行100次反应的量）： 500卜110\无钾离子扩增缓冲液（终浓度1父）； 500W 400mmol/L Poly N 1 5个碱基的随机引物（终浓度4(^mol/L); 25〇 4 2mmol/L 4 d N T P 混合液（每管终浓度 lOO^mol/L); lOOpl 5U/V1 Tag D N A 聚合酶（终浓度 0.1 U / W ) ; 用水调整至总体积4ml。 2. 将已载有裂解中和的单精子和对照的微量滴定板解冻。微量滴定板的每个孔均有一个单精子样本或对照。每孔加入40W P E P 反应试剂，混匀。如果 P C R 仪没有配置加热盖，那么每个孔应覆盖一层轻质液体石蜡油。采用以下扩增循环进行第一步： 5min 95〇C (变性) 5〇个循环： 2min 37 V (复性) 10s/°C 37°C升至 55°C 4min 55〇C (延伸) Imin 92〇C (变性) 最后一^ 步： 5min 72〇C (延伸) 3.将载有预扩增产物的96孔微量滴定板4°C 稳定、永久保存$

来源：丁香实验

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