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        方案8 通过肽的半胱氨酰化捕获蛋白质

        相关实验:质谱在蛋白质组学中的应用实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、变性、还原和缓冲液置换

        1.在真空干燥器中浓缩 120 ug 混合蛋白样品,直至完全干燥。

        2.将蛋白样品重新溶解在约 1ml 变性/还原缓冲液中,37°C 孵育 30 min,使样品变性还原。

        体积不掃要非常精确,因为在下一步操作中缓冲液还需置换。不过样品体积越小,需要置换的时间就越短。

        3.除去还原剂,降低尿素浓度以及除去缓冲液中的干扰成分。用约 4 ml 生物素化/胰酶消化缓冲液置换原液,在 Centricon YM-3 浓缩管中进行(4°C 离心)。

        二、标记 Biotin-HPDP 和缓冲液置换

        4.标记所有自由巯基。加入 50ul 4 mmol/L Biotin-HPDP(溶于 DMSO 中)到样品中(第③步操作后样品体积约为 1ml),室温孵育标记混合物 90 min。

        由于不确定标记反应是否能在 2mol/L 尿素存在的情况下有效进行, 所以可加人过量的 Biotin-HPDP。Biotin-HPDP 的量应大于亲和柱的结合能力(理论上,Img 抗生物素蛋白可结合 59nmol 的生物素)。

        5.用新鲜的生物素/胰酶消化缓冲液置换原液,以除去未结合的 Biotin-HPDP。

        置换在 CentriconYM-3 浓缩管中进行(4°C 离心)。

        未结合的 Biotin-HPDP 会与生物素化的多肽竞争结合抗生物素蛋白。

        第③步用过的 CentriconYM-3 浓缩管可在这一步重复使用。

        三、标记后蛋白混合物的消化

        6.加 1.5ug 胰酶到生物素化的样品中,孵育消化过夜(37°C)。

        7.用 PBS(含 1mmol/L EDTA) 稀释样品消化产物,使尿素浓度降到0.5 mol/L 以下。

        如果在几个小时内就用于抗生物素亲和柱,样品则可以在室温、4°C 或冰冻保存。若需要留存更长时间,则保存在-80°C。

        四、固定化抗生物素亲和柱捕获及洗脱

        8.用 5 ml PBS(含 lmmol/LEDTA) 平衡 1ml 固定化抗生物素亲和柱。

        9.将消化后的样品(来自第⑦步)加到亲和柱上,封闭亲和柱,室温孵育 30 min。注意不要让柱子变干。

        10.为收集不含半胱氨酸的多肽,用 10 ml PBS(含 1mmol/LEDTA) 淋洗柱子,并收集洗脱液。这样可获得穿透组分。

        11.从固定化抗生物素亲和柱上洗脱含半胱氨酸的多肽。

        (1)加 2 ml 含 50 mmol/LDTT(现用现加)的 PBS 到柱子上,使其进入柱子。

        (2)封闭柱子,室温孵育 30 min。

        (3)打开柱子,收集 2 ml 洗脱液,得到结合组分。

        五、烷基化和除盐

        12.如果要进行 LC-MS/MS 分析,需用 IAA(分别为 10 mmol/L 和 100 mmol/L) 对穿透组分和结合组分分别进行烷基化,避光室温作用 30 min。

        13.用 90% 甲酸酸化肽段(分别加 20 沁到结合组分,IOOiLd 到穿透组分),使甲酸终浓度为 1%。在脱盐前一直将样品保存在-80°C。

        14.根据厂商提供的使用说明,在 LC-MS/MS 之前用 Oasis HLB 抽提柱(或类似设备)对各个组分进行脱盐。

        来源:丁香实验

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