方案5 用 RP-HPLC 技术对多肽和蛋白质混合物进行脱盐实验

一、流动相的配制

1.配制缓冲液 A(弱流动相）和缓冲液 B(强流动相）各 1L，例如：

缓冲液 A:0.1%TFA 水溶液。

缓冲液 B:0.09%TFA 的 2-丙醇溶液。

要点：用于蛋白质测序的 TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于 RPHPLC 样品的洗脱。

2.在备好的量筒中用 Teflon 包被的磁转子将溶液搅拌均勻（时间视体积而定）。

3.用 0.2ul PTFE 过滤器过滤缓冲液 A 和 B。

4.将洗脱液瓶用塞子封闭，以防止有机溶剂挥发。

二、多肽和蛋白质样品的制备

1.检查样品的纯度。

2.如果存在不溶的蛋白、固体颗粒，则要用 0.2ul PTFE 滤膜过滤，或者离心样品后取上清液。

三、用 RP-HPLC 进行蛋白质脱盐

1.检测 HPLC 系统。

（1）进空白样（用洗脱液 A 进样），先在 100% 洗脱液 A 中等梯度洗脱，再在 100% 洗脱液 B 中等梯度洗脱，所有条件都与蛋白样品相同。

（2）用硫脲或硝酸钠（或其他不会发生交叉反应的溶液，例如盐溶液）来测量柱的死体积，从而确定盐的洗脱时间。

2.蛋白质脱盐。

（1）将含盐样品注入反相柱中，用 100% 洗脱液 A 洗脱，盐洗脱时间接近或正好是柱的死时间。

类似的方法可用于洗脱脲、盐酸胍等或样品中的许多低分子量成分，以备用于还原烷基化反应后或溶解/重折叠研究。它们来源于化学衍生反应、主链解离或部分还原反应、亚基-亚基解离，此外还可能来源于离子交换色谱、生物特异性亲和色谱或疏水相互作用色谱。

（2）用 100% 洗脱液 B—步洗脱或多步梯度洗脱蛋白。

（3）收集含蛋白的组分，以便进一步分析。