等电聚焦

等电聚焦

等电聚焦是测定抗体等电点（P l)的一个非常有用的方法。知 道 抗 体 的 p i 将决定在用 IE C 对抗体纯化时的正确纯化条件以及决定抗体的最佳储存条件。这个结果如同特定的抗体「指纹」，因为抗体根据制备方法的不同可产生一系列等电点电泳条带。抗体的等电点「指纹」在一些条件下会发生明显改变，如保存的缓冲液会发生变化、抗体的脱芻;基 ，以及抗体是来自体内或者体外培养技术等。

一、试剂

注 意 ：因 为 我 们用的是 BioRad Criterion C e ll 系统，所 以 我 们 用 他 们 的 试 剂 再 一 次强 调 ，下面内容只是一个例子而并不是必须遵照的。

抗 体 ：样品缓冲液中含 1〜2m g/m l

样品缓冲液：含 50 % 甘油的去离子水

10 X 阳极缓冲液

10 X 阴极缓冲液

IEF 标准： pi 4. 45〜9. 6

IE F 胶染色液

IE F 脱色液

二、 仪器

Criterion Cell 系统

C rite rio n 预制胶

三、 操作步骤

(1) 加 10 fxl的抗体于戴帽的样品管，再 加5uL的甘油。

(2) 准 备 IOjLtl的 p i 标准品。( 3 ) 用 10 X 储存溶液准备 60ml 阴极缓冲液。用 10 X 储 存 溶 液 准 备 400m l 阳极缓冲液。

(4) 从包装中取出预制胶并拔下梳子。用去离子水冲洗。

(5) 将预制胶放入 Criterion C e l l 系统装置中，将 60m l的阴极缓冲液注人上槽中。

(6) 将标准品和待测蛋白质样本上样于拔去梳子留下的胶孔。

( 7 ) 加 400 m l 阳极缓冲液于下槽中。

(8) 盖上电泳槽盖并接通电源。

(9) 打开开关, 设置电压到100V 时电泳 2. 5 h ，200V 时电 泳 1 h ，500V 时电泳 30 min 。

(10) 运 行 2. 5 h 后 ，关闭电源并拔掉导线。打开槽盖从电泳槽中取出胶匣。按照生产商的说明打开胶匣并暴露凝胶。

(11) 将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中染色 45 m in 。 用100 m l的脱色液进行脱色。需要更换脱色液几次。

(12) 保存凝胶。凝胶结果可用肉眼观察或进行扫描。