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        完整蛋白质从 SDS-PAGE 胶中的电洗脱及其 MALDI-TOF MS 分析

        相关实验:完整蛋白质从 SDS-PAGE 胶中的电洗脱及其 MALDI-TOF MS 分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        3.1 蛋白质检测

        一 般而言,凝胶染色和脱色非常易于操作。在本实验方法中,我们使用 ElectroBlue 染料代替有固定作用的考马斯亮蓝染色液显色蛋白质(见注释 1) 。

        完整蛋白质从 SDS-PAGE 胶中的电洗脱及其 MALDI-TOF MS 分析

        ( 1 ) SDS-PAGE 电泳后,用 300 ml Milli-Q 水或去离子水漂洗凝胶(8 cm X 10 cm ) 3 次,每次 10 min。

        ( 2 ) 用 ElectroBlue 染料给凝胶染色,用大约 20 ml 染色液浸泡凝胶(8 cm X 10 cm),缓慢摇动 2 h ( 见注释 3 )。

        ( 3 ) 用 300 mL Milli-Q 水或去离子水漂洗凝胶脱色,直至达到所需的凝胶背景。每 30 min 换一次水。

        3.2 电洗脱

        ( 1 ) 将电洗脱管垂直向上放置,加入 0.8 ml Milli-Q 水或去离子水,盖上盖。等待 10 min 并检查是否漏液。倒空管内液体(见注释 4) 。

        ( 2 ) 用一个干净,锋利的直刃剃刀将蛋白质条带从染色的凝胶上切下来,用一字镊子将凝胶碎片转移至电洗脱管中,在管中加入 1X 电泳缓冲液(0.8 ml) ,轻轻盖上盖,小心地将管安放在电洗脱仪的支持盘上,这样电流就可以直接通过两个薄膜窗(见注释 5 ) 。

        ( 3 ) 向电泳槽内灌入 1X 电泳缓冲液并将电洗脱支持盘放入槽内,确保电洗脱管完全浸泡在电泳缓冲液中,而且每根管的薄膜与电场垂直。

        ( 4 ) 120 V 电泳洗 2 h(见注释 6) 。

        ( 5 ) 电泳结束后,翻转正负极,并在相同电压下电泳 30~60 s ( 见注释 7) 。

        ( 6 ) 用镊子将凝胶碎片从电洗脱管中取出。轻轻盖上盖,将管子放回支持盘中。

        ( 7 ) 将支持盘放入盛有所需缓冲液或酸化水(1% 蚁酸)的 2 L 烧杯中。4°C 过夜透析,期间更换一次缓冲液。

        ( 8 ) 透析完成后,将蛋白质溶液转移至 1.5 mL 微量离心管中,用真空离心浓缩仪 ( SpeedVac) 浓缩至 5 μL 左 右 (见注释 8) 。

        ( 9 ) 将浓缩后的蛋白质溶液(1 μl ) 与基质溶液(1 μl,芥子酸,10 mg/ml 溶于 30% 乙腈)混合在 150 μl 微量离心管中,盖紧盖后 4°C 放置过夜,让蛋白质和基质共结晶(见注释 9) 。

        ( 10 ) 轻轻打开微量离心管盖并用 2 μl 移液器除去上清液。向管中加入 1 μl 基质溶液以重悬晶体,涡旋振荡,然后将其点样在 MALDI 样品板上(见注释 10)。

        来源:丁香实验

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