高镁法分离核仁

1. 准备溶液

Dulbecco’s 盐溶液：

0.136 mol/L NaCl

2.6 mmol/L KCl

8 mmol/L Na₂HPO₄

1.4 mmol/L KH₂PO₄，pH 7.0

蔗糖 A：

0.88 mol/L 蔗糖

12 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris ( pH 7.5)

蔗糖 B：

0.88 mol/L 蔗糖

1 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris ( pH 7.5)

0.1 moI/L PMSF 异丙醇溶液

核仁保存液：

0.88 mol/L 蔗糖

1 mmol/L MgCl₂

10 mmol/L Tris，50% (v/v) 甘油，pH 7.5

制备时先加入所有成分溶解。用 H₂O 调至 900 ml。最后用 HCl 调 pH 为 7.5，加 H₂O 至终体积为 1 L。

2. 离心收获细胞，用 Dulbeccc’s 盐溶液清洗 3 次。

3. 振荡或用宽松结合的 Teflon-玻璃匀浆器匀浆使细胞重悬浮于蔗糖 A 溶液中。

4. 重悬液用 RC-3 离心机，HG-41 转头 1000 g ( 2000 r/min ) 离心 10 分钟（也可用其他厂家的相应的离心机和转头）。

5. 用 2 倍体积的蔗糖溶液 A 重悬浮细胞，超声处理。

6. 处理后的细胞在 4℃，1200 g 离心 20 分钟。

7. 吸去上清，留下松散和坚固的沉淀，用蔗糖溶液 B 重悬浮。

8. 细胞核染色质和核仁进行 3~6 个循环的声波处理。

9. 处理后的悬液在 1200 g 离心 20 分钟。

10. 通过温和的摇晃，吹打或用宽松结合的玻璃匀浆器重悬浮核仁。

11. 确定产量，用适当体积的核仁保存液重悬浮核仁。