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        从人肝脏或胎盘组织中分离核仁

        相关实验:分离核仁实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 准备溶液:

        NKM:0.13 mol/L NaCl,5 mmol/L KCl,8 mmol/L 乙酸镁

        2.2 mol/L 蔗糖,10 mmol/L MgCl2

        0.88 mol/L 蔗糖

        0.34 mol/L 蔗糖,含 0.5 mmol/L MgCl2 或 0.5 mmol/L 乙酸镁

        2. 用大约 200 g 组织,切成小块(2~4 cm2 ) 通过一搅肉机。

        3. 用 NKM 悬浮搅碎的组织;最终体积大约为 850~900 ml。在一 500 ml 的离心管中 4500 g 离心 10 分钟。用 NKM 溶液洗两次。

        4. 称取洗过的沉淀的重量,悬浮于 100 ml 含 2.2 mol/L 蔗糖,10 mmol/L MgCl2 或乙酸镁的溶液中。用带紧密结合 Teflon 研棒,马达推动的 Potter-Elvehjem 匀浆器匀浆 10~12 次。

        5. 将匀浆用含 Mg2+ 的 2.2 mol/L 蔗糖溶液稀释至肝脏沉淀重量的 10 倍。

        6. 先后用一层和两层粗孔滤纸过滤匀浆。

        7. 过滤后的匀浆 20000 g 离心 2 小时。

        8. 用一干净的刮刀刮下沉淀。用一紧密结合 Tefflon-玻璃匀浆器匀浆使之溶于含 5 mmol/L Mg2+ 的 0.88 mol/L 蔗糖溶液中。2500 g 离心 20 分钟。

        9. 从细胞核沉淀中分离细胞核或核仁。

        (1) 分离细胞核

        ① 沉淀重悬浮于含 5 mmoI/L Mg2+ 的 0.34 mol/L 蔗糖溶液中。

        ② 下面加一层 0.88 mol/L 蔗糖溶液(无 Mg2+)。

        ③ 2500 g 离心 20 分钟。

        (2) 制备核仁

        ① 将第 8 步中得到的沉淀以每克组织 0.3 ml 的体积重悬浮于含 5 mmol/L Mg2+ 的 0.34 mol/L 蔗糖溶液中。

        ② 用一冰水冷却的菊花状振荡头进行超声处理。

        ③ 每 10 秒钟超声处理后进行 10 到 20 秒的冷却间隔,监测细胞核的破碎情况。

        10. 超声处理物从振荡头中取出放进一 50 ml 的塑料离心管中。

        11. 75 g 离心 4 分钟澄清超声处理物。

        12. 取出上清放到干净的离心管中。

        13. 下面加一层无 Mg2+ 的 0.88 mol/L 蔗糖溶液,2500 g 离心 20 分钟。

        14. 吸出上清。

        来源:丁香实验

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