SPISULA

卵母细胞收集和制备

1. 从成年海蚌中剥离卵巢和卵母细胞。然后在 1 g 重力作用下，用经 0.22 μm Millipore 滤器过滤的海水清冼几次卵母细胞。

匀浆

2. 为了在不激活卵母细胞的情况下使卵黄膜去稳定，将洗过的卵母细胞悬浮于含 1.4 mol/L 甘油，15 mmol/L NaHPO₄，pH 8.0，和 40 μg/ml 五羟黄酮的溶液中，室温孵育 8 分钟。

3. 500 g 离心 2 分钟收集卵母细胞，在最少量（例如，0.5 倍体积）的溶液 S 中轻轻地吹打进行重悬浮。

溶液 S：

0.25 mol/L 蔗糖

5 mmol/L PIPES，pH 7.2

0.75 mmol/L MgCl₂

0.5% (w/v) NP-40

0.5 mmol/L FMSF

4. 加入溶液 S 使卵母细胞最终稀释 20 倍，轻轻吹打以混合悬液，这样在 1 分钟之内会裂解卵母细胞。

分离细胞核

5. 将卵母细胞裂解液加到等体积的溶液 T 上，用 Beckman TJ-6 离心机在 1800 r/min 离心 10 分钟以分离细胞核。

溶液 T：

0.4 mol/L 蔗糖

5 mmol/L PIPES，pH 7.2

0.35 mmol/L MgCl₂

0.5 mmol/L PMSF

6. 仔细地弃去无细胞核上清，用溶液 S ( 总共 20 倍体积）重悬浮含细胞核的沉淀，重复第 5 步的离心步骤。

用核酸酶处理纯化的细胞核

7. 用 1 倍体积的含 0.25 mol/L 蔗糖，5 mmol/L PTPES，pH 7.2，0.35 mmol/L MgCl₂ 和 1% Trasylol 的溶液重悬浮细胞核。

8. 在重悬浮的细胞核中，加入 DNA 酶Ⅰ和 RNA 酶 A 至终浓度为 20 μg/ml，室温孵育 30 分钟。

用 1.5 mol/L NaCl 抽提核酸酶处理的细胞核

9. 将等体积的（1 倍体积）含 3 mol/L NaCl，20 mmol/L PIPES，pH 8.0，2 mmol/L EDTA 和 0.5 mmol/L PMSF 的溶液与含核酸酶的细胞核悬液混合。

10. 将悬液加到等体积的含 1.5 mol/L NaCl，10 mmol/L PIPES，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，0.25 mmol/L PMSF 和 0.44 mol/L 蔗糖的溶液上，用 Sorvall HB-4 转头在 11000 r/min 离心 30 分钟。

11. 用 1 倍体积的 5 mmol/L PIPES，pH 7.2 溶液清洗一遍富含细胞核纤层的沉淀。