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        哺乳动物组织/组织培养细胞

        相关实验:核纤层和富含核纤层组分的制备实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        组织制备

        1. 切碎组织,用加 250 mmol/L 蔗糖的 H 溶液清洗组织/组织培养物:

        溶液 H:

        15 mmol/L PIPES,pH 7.2

        80 mmol/L KCl

        15 mmol/L NaCI

        0.5 mmol/L 精咪

        0.2 mmol/L 精胺

        1 mmol/L DTT

        1 mmol/L PMSF

        细胞匀浆

        2. 清洗后,在二倍体积的含 250 mmol/L 蔗糖的溶液 H 中机械破碎细胞。

        纯化细胞核组分粗品

        3. 将细胞匀浆粗品用几层(例如 4 层)溶液 H 浸透的 eheesecloth 或 120 μm 尼龙网过滤。

        4. 过滤后,加入 6 倍体积含 2.3 mol/L,蔗糖的溶液 H(加入溶液的蔗糖终浓度为 1.62 mol/L,一共为 9 倍体积的含蔗糖的溶液 H),然后用 Sorvall SS34 转头在 15000 r/min 离心 30 分钟从稀释的滤液粗品中收集细胞核。

        制备纯细胞核

        5. 在一个带宽松结合(B)研杵的 Dounce 匀浆器中用 4 倍体积的含 1.0 mol/L 蔗糖的溶液 H 重悬浮细胞核沉淀粗品。

        6. 重悬浮的沉淀中加 6 倍体积含 2.3 mol/L 蔗糖的溶液 H,充分混匀(加入的溶液中的蔗糖终浓度为 1.78 mol/L;总共为 10 倍体积的含蔗糖的溶液 H)。

        7. 在每一离心管异质同晶聚合物超速离心管底部加入 4 ml 含 2.0 mol/L 蔗糖的溶液 H;上面加 34.5 ml 的重悬浮细胞核;用 Beckman SW27 或于与之对等的转头在 25000 r/min 离心 60 分钟。

        用 DNA 酶Ⅰ处理纯化的细胞核

        8. 离心后,用 0.25 倍体积的 0.1 mmol/L MgCl2,292 mmol/L 蔗糖,10 mmol/L 三乙醇胺-HCl,pH 8.5 溶液重悬浮经过蔗糖分部梯度纯化的细胞核(细胞核终浓度以光吸收法测定为 100 A260单位/ml)。重悬浮后立刻再用 0.1 mmol/L MgCl2,292 mmol/L 蔗糖,10 mmol/L 三乙醇胺-HCl,pH 8.5 溶液稀释到 20A260 单位/ml。

        9. 进行第一次 DNA 消化,加入 DNA 酶Ⅰ至终浓度为 1 μg/ml,22℃ 消化 15 分钟。

        10. 经 DNA 酶Ⅰ第一次消化后的细胞核悬浮液下面加 0.25 倍体积的 0.1 mmol/L MgCl2,876 mmol/L 蔗糖,10 mmol/L 三乙醇胺-HCl,pH 7.5 溶液,用 Sorvall HB-4 悬桶式转头 11000 r/min 离心 10 分钟。

        11. 用最小体积(例如,0.025 倍体积)的溶液 J 重悬浮细胞核沉淀。然后用溶液 J 稀释至终体积为用来进行第一次 DNA 酶Ⅰ消化所用体积的 1/5。

        溶液 J:

        0.1 mol/L MgCl2

        292 mmol/L 蔗糖

        10 mmol/L 三乙醇胺,pH 7.5

        12. 加入 DNA 酶Ⅰ至终浓度为 5 μg/ml,22℃ 消化 15 分钟进行第二次 DNA 消化。

        用非离子活化剂和 NaCl 抽提 DNA 酶Ⅰ处理的细胞核

        13. 离心回收消化的细胞核:经 DNA 酶Ⅰ第二次消化后的细胞核悬浮液下面加等体积的 0.1 mmol/L MgCl2,876 mmol/L 蔗糖,10 mmol/L 三乙醇胺-HCI,pH 7.5 溶液,用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟。

        14. 在得到的沉淀中加 0.225 倍体积的溶液 J,在匀浆器中用宽松结合的研杵 (B) 重悬浮细胞核。

        15. 在重悬浮细胞核组分中加入 0.025 倍体积的 20% (w/v) Triton X-100 使其终浓度为 2% (w/v),冰上孵育 10 分钟。

        16. 下面不加其他溶液,用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟回收细胞核,用 0.25 倍体积的溶液 J 在 Dounce 匀浆器中用宽松结合的研杵(B)重悬浮含有经 DNA 酶 Ⅰ处理,非离子活化剂抽提过的细胞核的沉淀组分.

        17. 在重悬浮细胞核中加入 0.25 倍体积的冷含 100 mmol/L 三乙醇胺-HCl,pH 7.5 的 2 mol/L NaCl,使 NaCl 的终浓度为 1 mol/L,冰上孵育 10 分钟。

        18. 用 Sorvall HB-4 转头 11000 r/min 离心 10 分钟回收核膜孔复合物-核纤层,用最少体积(例如,0.25 倍体积)的溶液 J 重悬浮。

        来源:丁香实验

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